膀胱尿路上皮癌組織中SRSF1及Caspase-3的表達(dá)水平及臨床意義

宰國(guó)真，王旭東，馬梅，李彥偉

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 病理科， 河南 鄭州 450052)

選擇性剪接為保持真核生物蛋白質(zhì)功能多樣性的重要途徑，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1]。絲氨酸/精氨酸富有剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1，SRSF1)為代表性選擇性剪接因子，相關(guān)研究證實(shí)，其在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象[2]。有研究指出，SRSF1可影響天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinecontaining aspartate specific proteinase，Caspase)、抗凋亡基因(Bcl-X)激活的DNA酶抑制蛋白的剪接，對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡、生長(zhǎng)起調(diào)控作用[3]。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinecontaining aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)為重要細(xì)胞凋亡效應(yīng)分子，可參與多種因素引起的細(xì)胞凋亡，其水平降低，可引起腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖。本研究探討膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌組織中SRSF1、Caspase-3的表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年3月至2019年6月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院收治的92個(gè)膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌手術(shù)或活檢標(biāo)本為觀察組，選取同期20個(gè)病理檢查結(jié)果為正常膀胱尿路上皮組織的活檢標(biāo)本為對(duì)照組。對(duì)照組：男12例，女8例；年齡34～78歲，平均(51.26±8.52)歲。觀察組：男56例，女36例；年齡35～76歲，平均(50.29±6.34)歲；腫瘤分級(jí)為53例高級(jí)別，39例低級(jí)別。所有病理切片由3名資深病理醫(yī)生根據(jù)WHO(2004)泌尿系統(tǒng)和男性生殖器官腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)診。標(biāo)本經(jīng)100 g·L-1的中性緩沖福爾馬林固定、石蠟包埋，做成厚4 μm的石蠟切片。兩組性別、年齡、腫瘤分級(jí)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶方法(streptavidin peroxidase，SP)，按照免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)說(shuō)明操作。兔抗人SRSF1多克隆抗體、兔抗人Caspase-3多克隆抗體均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。采用梯度酒精、二甲苯對(duì)切片進(jìn)行脫蠟水化，采用體積分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)氧化氫室溫處理10 min，進(jìn)行微波抗原修復(fù)，加入正常山羊血清室溫孵育15 min，滴加稀釋濃度為1∶200的一抗，在4 ℃保濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，室溫孵育10 min，滴加鏈親和素顯色10 min。采用蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。以磷酸緩沖鹽溶液作陰性對(duì)照。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)參考說(shuō)明書觀察SRSF1和Caspase-3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況，SRSF1主要定位于細(xì)胞核，Caspase-3主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃(褐)色判讀為陽(yáng)性。在高倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。染色強(qiáng)度打分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無(wú)色為0分，并于背景著色對(duì)比。陽(yáng)性細(xì)胞占比打分：陽(yáng)性細(xì)胞>75%為4分，51%～75%為3分，11%～50%為2分，1%～10%為1分，陰性為0分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比乘以染色強(qiáng)度≥3分為陽(yáng)性(+)。

1.4 觀察指標(biāo)(1)SRSF1表達(dá)及臨床意義。(2)Caspase-3表達(dá)及臨床意義。(3)SRSF1與Caspase-3表達(dá)相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。SRSF1、Caspase-3表達(dá)以頻數(shù)和率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman對(duì)SRSF1、Caspase-3表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRSF1表達(dá)觀察組SRSF1陽(yáng)性表達(dá)率[84.78%(78/92)]高于對(duì)照組[10.00%(2/20)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。觀察組中單發(fā)與多發(fā)、低級(jí)別與高級(jí)別、轉(zhuǎn)移與無(wú)轉(zhuǎn)移及不同臨床分期SRSF1陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；復(fù)發(fā)性膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌組織中SRSF1陽(yáng)性表達(dá)率高于原發(fā)性癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 觀察組SRSF1表達(dá)及臨床意義[n(%)]

2.2 Caspase-3表達(dá)觀察組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率[30.43%(28/92)]低于正常組[90.00%(18/20)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組中單發(fā)與多發(fā)、原發(fā)與復(fù)發(fā)、低級(jí)別與高級(jí)別、轉(zhuǎn)移與無(wú)轉(zhuǎn)移及不同臨床分期Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 觀察組Caspase-3表達(dá)及臨床意義[n(%)]

2.3 SRSF1與Caspase-3表達(dá)相關(guān)性觀察組78例SRSF1陽(yáng)性表達(dá)中60例Caspase-3呈陰性表達(dá)，發(fā)生率為76.92%(60/78)，14例SRSF1陰性表達(dá)中10例Caspase-3呈陽(yáng)性表達(dá)，發(fā)生率為71.43%(10/14)，兩種蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性18例，均為陰性4例。以Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，觀察組Caspase-3與SRSF1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.369，P<0.05)。

3 討論

膀胱癌為常見泌尿外科惡性腫瘤，近年來(lái)，其發(fā)病率、病死率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康，且其發(fā)病機(jī)制尚未明確[4]。選擇性剪接在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，SRSF1與腫瘤直接相關(guān)，相關(guān)研究證實(shí)，SRSF1調(diào)控可變剪接事件可促進(jìn)腫瘤發(fā)生，同時(shí)可調(diào)控細(xì)胞侵襲、運(yùn)動(dòng)，與惡性腫瘤特點(diǎn)相同[5]。研究顯示，SRSF1還通過(guò)調(diào)控Bcl-X和Caspase激活的DNA酶抑制蛋白的剪接對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡產(chǎn)生影響[6]。此外，肺癌中SRSF1可與抗凋亡蛋白Survivin mRNA結(jié)合，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，并促進(jìn)其翻譯，使其表達(dá)增加，同時(shí)抑制Caspase蛋白，抑制肺癌細(xì)胞凋亡[7]。細(xì)胞中Caspase蛋白家族通常以酶原(無(wú)活性)形式存在，但Caspase可自我活化、相互激活，呈級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)參與凋亡過(guò)程，其中Caspase-3尤其重要，可破壞細(xì)胞核纖層，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，參與多種因素引起的細(xì)胞凋亡[8]。

本研究以免疫組化法檢測(cè)SRSF1、Caspase-3在膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌與正常膀胱黏膜組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對(duì)照組SRSF1陽(yáng)性表達(dá)率低于觀察組，復(fù)發(fā)性膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌中SRSF1陽(yáng)性表達(dá)率高于原發(fā)性癌。這表明在膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌中SRSF1高表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。觀察組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，提示Caspase-3可能與腫瘤耐凋亡特征有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中Caspase-3低表達(dá)，且與膀胱癌復(fù)發(fā)密切相關(guān)[9]。本研究中Caspase-3蛋白表達(dá)降低與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期無(wú)相關(guān)性，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本研究相關(guān)性分析顯示，觀察組Caspase-3與SRSF1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示SRSF1有抑制Caspase-3的作用，兩者呈反向平衡。Caspase-3、SRSF1共同調(diào)節(jié)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞凋亡，與其發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

綜上可知，SRSF1可能通過(guò)增加抗凋亡蛋白對(duì)Caspase-3起抑制作用，以抑制膀胱尿路上皮癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，SRSF1與膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)關(guān)系密切，膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌組織中SRSF1高表達(dá)與Caspase-3低表達(dá)對(duì)膀胱尿路上皮癌患者病情進(jìn)展起促進(jìn)作用。