苯甲酰芍藥苷對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷保護作用及分子機制研究

周垂楊 楊 明 高仁賢

急性肺損傷（ALI）及其更嚴重形式急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）病理過程是由于肺部廣泛的炎癥反應，可能導致肺間質(zhì)水腫，肺順應性惡化，引起嚴重低氧血癥[1-2]。ALI 死亡率較高，約為40%[3]。ALI 的發(fā)病機制是由累積和激活的炎癥細胞，促炎性細胞因子和趨化因子的分泌以及活性氧類別（ROS）的釋放導致的急性炎癥反應[4-5]。研究表明，抗炎介質(zhì)或抗炎藥物可以治療早期ALI[6]。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細菌中外膜的主要成分，是先天免疫系統(tǒng)的極強刺激物，在數(shù)種動物模型中常被用來誘導ALI[7-8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，部分中藥用于治療ALI 具有較好療效，其作用機制與炎癥信號調(diào)控和microRNA 生成有關[9]。苯甲酰芍藥苷是毛茛科植物芍藥、牡丹根部（赤芍）的提取物芍藥總苷中的單體成分，此前研究發(fā)現(xiàn)，芍藥總苷能夠減輕LPS 誘導的小鼠ALI，然而其具體作用成分尚不明確[10]?；诖?，本研究探討苯甲酰芍藥苷對小鼠ALI 的作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 實驗用75 只SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量22～25g，6～7 周齡，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號：SCXK（滬）2018-0006。小鼠飼養(yǎng)于溫度18～26℃、相對濕度40%～70%環(huán)境中，自由飲水進食，晝夜各12h。本實驗研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核通過，批準編號：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 細 胞 小鼠巨噬細胞系RAW264.7（批號260748）購自南京科佰生物科技有限公司。

1.3 藥 物 苯甲酰芍藥苷（批號51165123）購自深圳虹彩祥根生物科技有限公司，溶于無菌生理鹽水，配制成低濃度0.625mg/mL 及高濃度1.250mg/mL，動物及細胞實驗用苯甲酰芍藥苷參考芍藥總苷動物實驗用量。

1.4 試 劑 血必凈注射液（規(guī)格：10mL×5 支/盒，批號190845）購自醫(yī)院藥房，產(chǎn)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號20180648）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（批號1541216）、小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（批號2165216）均購自艾美捷科技有限公司；微小RNA 520c-3p（miR-520c-3p）inhibitor 及對照品NC（批號21651）購自北京百奧萊博科技有限公司；磷酸化IκB激酶（p-IKKβ）兔單抗（批號26542）、IKKβ 兔單抗（批號22642）、核因子κB（NF-κB）p-p65 兔單抗（批號32645）、NF-κB p65 兔單抗（批號45142）均購自武漢三鷹生物技術有限公司，Actin 作為內(nèi)參。

1.5 儀 器 上海恒平FA2004 電子分析天平購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司；GDW/GDJS-100高低溫（濕熱）試驗箱購自上海蘇盈試驗儀器有限公司；Alpha 化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Cell Biosciences 公司；SpectraMax iD5 多功能微孔酶標儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；Life Technologies ABI QuantstudioTMDX 定量PCR 儀購自中山大學達安基因股份有限公司。

2 實驗方法

2.1 小鼠ALI 模型構建及藥物干預 將75 只SPF級小鼠按隨機數(shù)字表法分成五組，每組15 只，分別為空白對照組、ALI 組、陽性對照組、苯甲酰芍藥苷低劑量組、苯甲酰芍藥苷高劑量組。小鼠造模前16h 內(nèi)禁食，造模時使用4%水合氯醛麻醉，采用腹腔注射法，ALI 組、陽性對照組、苯甲酰芍藥苷低、高劑量組小鼠腹腔注射2mg/kg LPS 100μL，空白對照組腹腔注射等體積生理鹽水，4h 后苯甲酰芍藥苷低劑量組小鼠腹腔注射2.5mg/kg 苯甲酰芍藥苷100μL，高劑量組注射5.0mg/kg 苯甲酰芍藥苷100μL，陽性對照組注射血必凈注射液100μL，ALI 組和空白對照組注射相同劑量生理鹽水。24h 后取肺組織稱重，并計算濕/干重比。

2.2 小鼠肺組織石蠟切片HE 染色 取出小鼠肺組織后放入4%多聚甲醛進行固定，經(jīng)TISSUE-TEK AUTOTEC A120 自動化樣本制備系統(tǒng)實現(xiàn)組織石蠟包埋，制成0.4μm 石蠟切片。按照HE 染色試劑盒說明書操作進行染色，中性樹脂分片，通過HE 全自動切片掃描儀掃描成像，選取HE 染色肺組織特征性區(qū)域展示。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測ALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平 取約5mg 小鼠肺組織，在管中加入約300μL 完全提取緩沖液并用電動勻漿器勻漿，在4℃下以13000rpm 轉速離心20min。取上清液放在預冷的新鮮試管中，并在-80℃下保存樣品。按照ELISA 檢測試劑盒操作步驟檢測肺組織TNF-α、IL-6 水平。使用多功能酶標儀測定450nm 吸光度值。

2.4 蛋白免疫印跡（WB）法檢測ALI 小鼠肺組織IKKβ、NF-κB p65 蛋白及其磷酸化水平 利用RIPA 強組織裂解液裂解組織蛋白后，經(jīng)過離心取上清蛋白樣，測定蛋白濃度，進行蛋白凝膠電泳。孵育一抗稀釋比：IKKβ（1:1000）、p-IKKβ（1:1000）、NF-κB p65（1:1000）、NF-κB p-p65（1:1000）、Actin（1:5000）。利用化學二抗孵育并進行曝光分析。

2.5 細胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細胞系RAW264.7 的完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，并加入1%的青霉素-鏈霉素雙抗。于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞密度達到85%～90%進行傳代。將A549鋪板于6cm 皿中，分為五組：空白對照組、ALI 組、苯甲酰芍藥苷組、苯甲酰芍藥苷+miR-520c-3p inhibitor 組、苯甲酰芍藥苷+miR-NC 組。后兩組各預先轉染miR-520c-3p inhibitor 和NC 24h。ALI 組、苯甲酰芍藥苷組、苯甲酰芍藥苷+miR-520c-3p inhibitor 組、苯甲酰芍藥苷+miR-NC 組加入80ng/mL LPS 刺激，同時后三組加入苯甲酰芍藥苷100ng/mL，空白對照組加入等體積生理鹽水，處理6h 后提取RNA。關于探究miR-506-3p 抑制劑對苯甲酰芍藥苷作用于細胞TNF-α、IL-6 的影響，設置四組：空白對照組給予生理鹽水刺激6h；ALI 組給予LPS（80ng/mL）刺激6h；苯甲酰芍藥苷組給予LPS（80ng/mL）刺激6h+苯甲酰芍藥苷（100ng/mL）；苯甲酰芍藥苷+miR-520c-3p inhibitor 組給予預轉染miR-520c-3p inhibitor 24h，LPS（80ng/mL）刺激6h+苯甲酰芍藥苷（100ng/mL）；苯甲酰芍藥苷+miR-NC 組給予預轉染miR-NC 24h，LPS（80ng/mL）刺激6h+苯甲酰芍藥苷（100ng/mL）。收取細胞上清進行ELISA 法檢測，具體步驟見上述。

2.6 RT-PCR 檢測miR-520c-3p、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平 提取細胞RNA 后逆轉為cDNA 進行RTPCR 檢測，引物如下：miR-520c-3p 引物：forward 5′-ATCGCCGTGTAAAAGGAAGAGGGCTGAGGAATTCAT-3′，reverse 5′-CACTGGACTAGTGGAGGAGAGCACATAAAAACATC-3′；TNF-α 引物：forward 5′-CGGCTACCTAGTCTACGCC-3′，reverse 5′-AAGTCGCCGCCAATGTTGA-3′；NF-κB p65 引物：forward 5′-ATCCCATCTTTGACAATCGTGC-3′，reverse 5′-CTGGTCCCGTGAAATACACCTC-3′。引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。反應程序：94℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)32 次。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（） 表示，數(shù)據(jù)分析組內(nèi)比較采用t 檢驗，組間比較采用方差檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 苯甲酰芍藥苷降低ALI 小鼠肺組織濕/干重比與空白對照組比較，ALI 組肺組織濕/干重比明顯升高（P＜0.05），與ALI 組比較，苯甲酰芍藥苷低、高劑量組及陽性對照組小鼠肺組織濕/干重比均明顯下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肺組織濕/干重比比較（）

表1 各組小鼠肺組織濕/干重比比較（）

注：空白對照組給予腹腔注射生理鹽水200μL；ALI 組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+生理鹽水100μL；陽性對照組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+血必凈注射液100μL；苯甲酰芍藥苷低劑量組給予腹腔注射LPS （2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（2.5mg/kg，100μL）；苯甲酰芍藥苷高劑量組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（5.0mg/kg，100μL）；ALI 為急性肺損傷；與空白對照組比較，aP＜0.05；與ALI 組比較，bP＜0.05

3.2 苯甲酰芍藥苷對各組ALI 小鼠肺組織病理變化的影響 空白對照組小鼠肺組織呈現(xiàn)氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞，呼吸道和肺泡上皮結構完整。肺泡形態(tài)均勻，纖毛排列整齊。而ALI 組小鼠肺泡和肺泡隔中可見大量炎性細胞浸潤，肺泡隔中可見增厚。在肺組織觀察到明顯的毛細血管充血、水腫和肺泡出血，表明成功建立肺損傷模型。與ALI 組比較，苯甲酰芍藥苷低、高劑量組小鼠肺組織炎性細胞浸潤明顯減少，肺泡中隔增厚情況減輕，毛細血管幾乎無充血情況。見插頁圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE，100×）

3.3 苯甲酰芍藥苷降低ALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平 與空白對照組比較，ALI 組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平明顯升高（P＜0.05）；與ALI 組小鼠比較，苯甲酰芍藥苷低、高劑量組及陽性對照組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平均明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 苯甲酰芍藥苷對ALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6 的影響（pg/mL，）

表2 苯甲酰芍藥苷對ALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6 的影響（pg/mL，）

注：空白對照組給予腹腔注射生理鹽水200μL；ALI 組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+生理鹽水100μL；陽性對照組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+血必凈注射液100μL；苯甲酰芍藥苷低劑量組給予腹腔注射LPS （2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（2.5mg/kg，100μL）；苯甲酰芍藥苷高劑量組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（5.0mg/kg，100μL）；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；ALI 為急性肺損傷；與空白對照組比較，aP＜0.05；與ALI 組比較，bP＜0.05

3.4 苯甲酰芍藥苷抑制ALI 小鼠肺組織IKKβ/NFκB 信號 ALI 組IKKβ、NF-κB p65 磷酸化水平明顯高于空白對照組，總IKKβ、NF-κB p65 表達無明顯差異；苯甲酰芍藥苷低、高劑量組與ALI 組比較，IKKβ、NF-κB p65 磷酸化水平明顯下降，同時總NF-κB p65 水平也明顯下降，總IKKβ 水平無明顯變化。推測苯甲酰芍藥苷可能通過抑制NF-κB 的表達抑制了炎癥信號。見插頁圖2。

圖2 各組小鼠肺組織IKKβ/NF-κB 及其磷酸化表達

3.5 苯甲酰芍藥苷促進ALI 小鼠肺組織miR-520c-3p 表達 與空白對照組比較，ALI 組小鼠肺組織miR-520c-3p 表達明顯下調(diào)（P＜0.05）；與ALI 組比較，苯甲酰芍藥苷低、高劑量組及陽性對照組小鼠肺組織miR-520c-3p 表達均明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肺組織miR-520c-3p 表達比較（）

表3 各組小鼠肺組織miR-520c-3p 表達比較（）

注：空白對照組給予腹腔注射生理鹽水200μL；ALI 組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+生理鹽水100μL；陽性對照組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+血必凈注射液100μL；苯甲酰芍藥苷低劑量組給予腹腔注射LPS （2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（2.5mg/kg，100μL）；苯甲酰芍藥苷高劑量組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（5.0mg/kg，100μL）；ALI 為急性肺損傷；與空白對照組比較，aP＜0.05；與ALI 組比較，bP＜0.05

3.6 miR-506-3p 靶向NF-κB p65 亞基RELA 基因序列 通過microRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫Targetscan 7.0 軟件分析結果顯示，miR-506-3p 直接靶向NFκB p65 亞基RELA 基因3′UTR 序列。見表4。

表4 miR-506-3p 靶向NF-κB p65 亞基RELA 基因序列

3.7 miR-506-3p 抑制劑減輕苯甲酰芍藥苷對TNFα、IL-6 表達抑制的影響 與空白對照組比較，ALI組細胞TNF-α、IL-6 mRNA 水平明顯升高（P ＜0.05）；與ALI 組比較，苯甲酰芍藥苷組TNF-α、IL-6 mRNA 水平明顯下降（P＜0.05）；與苯甲酰芍藥苷組比較，苯甲酰芍藥苷+miR-520c-3p inhibitor 組TNFα、IL-6 mRNA 水平明顯升高（P＜0.05），苯甲酰芍藥苷+miR-NC 組TNF-α、IL-6 mRNA 表達無差異（P＞0.05）。見表5。

4 討論

ALI 的特征在于急性炎性反應，炎性細胞浸潤，滲出性分泌物，肺細胞死亡的釋放以及隨后的實質(zhì)損傷。研究表明，巨噬細胞在ALI 急性期的免疫反應和炎癥過程中也起著至關重要的作用，該過程通過釋放炎性因子促進中性粒細胞募集進一步釋放促炎性因子TNF-α、IL-6 等[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酰芍藥苷能有效抑制LPS 誘導的小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平。因此，苯甲酰芍藥苷可能通過抑制TNF-α、IL-6 的水平緩解LPS 誘導ALI。

為了進一步探究苯甲酰芍藥苷緩解LPS 誘導ALI 的分子機制。本研究檢測了小鼠肺組織中IKKβ/NF-κB 信號，結果顯示，苯甲酰芍藥苷能有效降低IKKβ、NF-κB p65 磷酸化水平以及總NF-κB p65水平。NF-κB 代表轉錄因子家族，通常通過與IκB 家族的抑制分子相互作用而在細胞質(zhì)中保持失活。響應多種刺激（例如炎性細胞因子，細菌或病毒產(chǎn)物或各種類型的應激），IκB 分子在兩個關鍵的絲氨酸殘基上被磷酸化。該修飾允許它們的多泛素化和被蛋白酶體破壞。游離的NF-κB 進入細胞核并激活各種基因的轉錄，如TNF-α、IL-1β 和IL-6，這些基因參與了免疫和炎癥反應，在ALI 發(fā)展和發(fā)病機制中起關鍵作用[13]。這也進一步提示苯甲酰芍藥苷可能通過抑制IKKβ/NF-κB 信號活化減低TNF-α、IL-6 水平。

此前研究發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p 靶向NF-κB p65序列，參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。推測苯甲酰芍藥苷可能通過調(diào)控miR-506-3p 介導NF-κB 炎癥信號。進一步實驗結果發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p 在ALI 中表達下調(diào)，而苯甲酰芍藥苷能夠明顯上調(diào)miR-506-3p 的表達，同時利用miR-506-3p inhibitor 能有效逆轉苯甲酰芍藥苷對炎癥因子TNF-α、IL-6 水平的抑制作用。

總之，苯甲酰芍藥苷通過減少炎癥因子TNF-α、IL-6 的產(chǎn)生，對LPS 誘導的小鼠ALI 具有保護作用。苯甲酰芍藥苷的抗炎機制可能涉及促進miR-506-3p 的表達，抑制IKKβ/NF-κB 途徑。因此，苯甲酰芍藥苷可能是ALI 的潛在治療藥物。后續(xù)全面研究驗證將推進苯甲酰芍藥苷進入臨床應用。

表5 miR-506-3p 抑制劑對苯甲酰芍藥苷調(diào)控TNF-α、IL-6 mRNA 的影響（）

表5 miR-506-3p 抑制劑對苯甲酰芍藥苷調(diào)控TNF-α、IL-6 mRNA 的影響（）

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子α；IL-6 為白介素-6；ALI 為急性肺損傷；與空白對照組比較，aP＜0.05；與ALI 組比較，bP＜0.05；與苯甲酰芍藥苷組比較，cP＜0.05