真武湯在縮窄性心包炎患者圍術(shù)期應(yīng)用價(jià)值及其機(jī)制研究

鐘方明 楊 俊 朱鵬飛 陳 達(dá)

縮窄性心包炎常因心包慢性炎癥導(dǎo)致心包增厚、粘連甚至鈣化，致使心功能惡化，長(zhǎng)期臨床預(yù)后不良，一經(jīng)確診應(yīng)盡早進(jìn)行縮窄心包的剝脫與切除[1-2]。目前臨床常規(guī)采取術(shù)前積極糾正低蛋白血癥、利尿消腫、胸腹腔引流等措施改善圍術(shù)期心功能，但臨床療效有限，且易誘發(fā)水電解質(zhì)紊亂。真武湯出自張仲景《傷寒論》，有溫陽(yáng)化氣利水之功，可有效改善心衰證候。研究證實(shí)，真武湯及其衍生組方能通過(guò)減輕心肌纖維化、肥大等病理性組織重塑，改善心功能[3-4]。本研究探討真武湯在縮窄性心包炎圍手術(shù)期的治療效果，初步研究其抑制心包組織纖維化改善心功能的具體機(jī)制，報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 納入2013 年9 月—2018 年12 月期間于浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胸外科住院治療并確診為縮窄性心包炎患者80 例，中醫(yī)辨證分型為陽(yáng)虛水泛證，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和真武湯組，每組40 例。本研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，與所有受試者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 縮窄性心包炎診斷參考2004 年歐洲心臟病學(xué)會(huì)制訂的心包疾病診斷與治療指南[5]；中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)參照第2 版《中醫(yī)診斷學(xué)》[6]。

1.3 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合縮窄性心包炎西醫(yī)診斷及陽(yáng)虛水泛證中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)者；（2）心功能Ⅱ～Ⅲ級(jí)；（3）年齡＜75 歲；（4）受試者自愿配合，依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者；（2）合并有意識(shí)障礙或精神疾病者。

1.4 藥物及主要試劑 真武湯煎劑（茯苓、白芍、生姜各45g，白術(shù)30g，制附子15g，購(gòu)于杭州華東中藥飲片有限公司），每劑加水煎成200mL。恒溫離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造，型號(hào)：TDL－40B）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀ABI7500（美國(guó)Applied Biosystems公司）。Human NT Pro-BNP DuoSet ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D 公司（批號(hào)DY3604-05）。I 型膠原蛋白（Collagen I）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen Ⅲ）、彈性蛋白（Elastin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2（TIMP-2）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物委托上海Sangon 合成。Collagen I 引物序列參數(shù)：上游5'-GACCGATGGATTCCAGTTCG-3'，下游5'-TGTGACTCGTGCAGCCATCG-3'；Collagen Ⅲ引物序列參數(shù)：上游5'-AGATGTCCTTGATGTGCAGC-3'，下游5'-CCACCAATGTCATAGGGTGC-3'；Elastin 引物序列參數(shù)：上游5'-CCTCAAAGCTGGATTCGCTCT-3'，下游5'-GGCAAGGTGGCTATTCCCA-3'；MMP-1 引物序列參數(shù)：上游5'-ATGCTGAAACCCTGAAGGTG-3'，下游5'-CTGCTTGACCCTCAGAGACC-3'；MMP-2 引物序列參數(shù)：上游5'-AGGGCACATCCTATGACAGC-3'，下游5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3'；MMP-9 引物序列參數(shù)：上游5'-CCTGGAGACCTGAGAACCAATC-3'，下游5'-GATTTCGACTCTCCACGCATCT-3'；MMP-13 引物序列參數(shù)：上游5'-GCTGCCTTCCTCTTCTTGAG-3'，下游5'-TGCTGCATTCTCCTTCAGGA-3'；TIMP-1 引物序列參數(shù)：上游5'-TTGGCTGTGAGGAATGCACA-3'，下游5'-TTTTCAGAGCCTTGGAGGAGC-3'；TIMP-2 引物序列參數(shù)：上游5'-GCAAGATGCACATCACCC-3'，下游5'-CGTCACTTCTCTTGATGC-3'；GAPDH 引物序列參數(shù)：上游5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。磷酸酶抑制劑混合物-1（批號(hào)P2850）和二抗（兔）（批號(hào)A8257） 購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；TGF-β1（批號(hào)#3709S）、p-Smad2（批號(hào)#3108S）、p-Smad3（批號(hào)#9520S）一抗均購(gòu)自Cell'Signaling'Technology 公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（NCM'Biotech）購(gòu)自新賽美生物科技有限公司（批號(hào)P10010）。

2 方 法

2.1 治療方法 所有患者均經(jīng)胸骨正中切口徑路施行心包剝除術(shù)，按先左心后右心的順序剝離增厚心包。切開(kāi)左心前增厚的心包，順序游離心尖、左室前壁和側(cè)壁心包并予以切除。心包切除范圍：兩側(cè)至膈神經(jīng)前緣，上至大血管根部，下至膈面及心尖，并松解上下腔靜脈入口瘢痕組織。兩組患者圍手術(shù)期治療均予以術(shù)后抗感染、抗結(jié)核（結(jié)核性心包炎患者）、強(qiáng)心利尿、維持電解質(zhì)平衡及水的負(fù)平衡、激素治療及胸腹腔引流等常規(guī)方案治療[5]。真武湯組術(shù)前1 周在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用真武湯，藥物：茯苓、白芍、生姜各45g，白術(shù)30g，制附子15g，加水煎煮至200mL，1 天1 劑，分早晚2 次口服，總療程為2 周。

2.2 心功能指標(biāo)檢測(cè) 于術(shù)前及術(shù)后第8 天晨起時(shí)空腹抽取每位患者靜脈血5mL，離心處理4000r/min，8min，取其上清液，置于-18℃恒溫箱中留存。采用ELISA 法分別檢測(cè)其血漿NT-proBNP 的水平，并行超聲心動(dòng)圖檢查兩組治療前后左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

2.3 病理組織形態(tài)學(xué)觀察 取存檔的石蠟包埋心包組織標(biāo)本，保證切片完整、厚度均勻（4～6μm），徹底脫水透明，用中性樹(shù)膠封蓋。最后蘇木精液染色后，光鏡下觀察心包組織的病理特征。

2.4 RT-qPCR 檢測(cè)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平 取新鮮心包組織標(biāo)本，采用Trizol 法提取總RNA，測(cè)OD 值（RNA OD280/OD260 為1.9）。反轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription，RT）以Takara 公司附帶的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為標(biāo)準(zhǔn)，合成cDNA。采用SYBR Green I 熒光染料技術(shù)進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative Polymerase Chain Reactionq，qPCR）。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，所有原始數(shù)據(jù)采用LightCycler 96 SW 1.1 軟件進(jìn)行分析，以GAPDH 作為內(nèi)部參照。

2.5 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取液氮凍存的心包組織樣本，研碎后加入RIPA 裂解液，冰上孵育30min，12000rpm 離心后取上清液，BCA 法測(cè)定并調(diào)整樣本蛋白濃度，加Loading Buffer 95℃變性5min，-20℃保存。取各組樣本10μg 進(jìn)行上樣，在10% SDS-PAGE 膠中電泳（濃縮膠80V，分離膠120V），并濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上（300mA 恒流90min），用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入對(duì)應(yīng)一抗（1:1000稀釋），4℃冰箱搖床（轉(zhuǎn)速40rpm）過(guò)夜。TBST 洗滌10min×3 次（轉(zhuǎn)速80rpm）。然后，加入山羊抗兔二抗孵育2h（1:5000 稀釋），再次以TBST 洗滌10min×3次。最后用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（A:B 液=1：1）顯色，原始圖像采用Imgae J 軟件處理，以GAPDH（1:5000 稀釋）為內(nèi)部參照，相對(duì)灰度值以與GAPDH比值結(jié)果表示。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例（n）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組縮窄性心包炎患者一般資料比較 對(duì)照組40 例，男21 例，女19 例；年齡42～75（57.1±5.8）歲；心功能Ⅱ級(jí)15 例，Ⅲ級(jí)25 例；病程4～16（8.8±4.3）年。真武湯組40 例，男18 例，女22 例；年齡46～75（58.6±5.2）歲；心功能Ⅱ級(jí)14 例，Ⅲ級(jí)26 例；病程3～14（7.9±3.2）年。兩組患者基線資料，包括性別、年齡、心功能分級(jí)以及病程方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 兩組縮窄性心包炎患者血漿NT-proBNP 以及心功能指標(biāo)比較 兩組患者行心包剝除術(shù)前血漿NT-proBNP 以及心功能指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而心包剝除術(shù)后，兩組血漿NT-proBNP及心功能指標(biāo)均有所改善，且真武湯組患者比較對(duì)照組血漿NT-proBNP、LVEDD、LVESD 水平有所降低，LVEF 則顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3.3 兩組縮窄性心包炎患者心包組織病理 對(duì)照組心包組織中膠原纖維含量增多、玻璃樣變性，且有明顯鈣化；真武湯組膠原纖維含量降低，玻璃樣變性程度相對(duì)減輕。見(jiàn)插頁(yè)圖1。

圖1 兩組縮窄性心包炎患者心包組織病理變化（HE 染色400×）

3.4 兩組縮窄性心包炎患者心包組織纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平比較 RT-qPCR 表明真武湯組心包組織Collagen I 和Collagen Ⅲ表達(dá)量較對(duì)照組有所降低，Elastin 表達(dá)量相對(duì)增高（P＜0.05）。且比較于對(duì)照組，真武湯組患者心包組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 轉(zhuǎn)錄水平以及MMP-2/TIMP-2 和MMP-9/TIMP-1 比率明顯降低，MMP-1 和MMP-13 轉(zhuǎn)錄水平及MMP-1/TIMP-1 和MMP-13/TIMP-1 比率均顯著增高，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3.5 兩組縮窄性心包炎患者心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達(dá)水平比較 Western blot 顯示，真武湯組心包新鮮標(biāo)本提取物TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低，見(jiàn)表3、插頁(yè)圖2。

表1 兩組縮窄性心包炎患者血漿NT-proBNP 以及心功能指標(biāo)比較（）

表1 兩組縮窄性心包炎患者血漿NT-proBNP 以及心功能指標(biāo)比較（）

注：對(duì)照組給予常規(guī)方案治療；真武湯組常規(guī)治療基礎(chǔ)上加真武湯治療；NT-proBNP 為N 末端腦鈉肽；LVEDD 為左室舒張末期內(nèi)徑；LVESD 為左室收縮末期內(nèi)徑；LVEF 為左室射血分?jǐn)?shù)；與本組治療前比較，aP＜0.05；與對(duì)照組同期比較，bP＜0.05

表2 兩組縮窄性心包炎患者心包組織纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平比較（）

表2 兩組縮窄性心包炎患者心包組織纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平比較（）

注：對(duì)照組給予常規(guī)方案治療；真武湯組常規(guī)治療基礎(chǔ)上加真武湯治療；Collagen I 為I 型膠原蛋白；Collagen Ⅲ為Ⅲ型膠原蛋白；Elastin 為彈性蛋白；MMP-1 為基質(zhì)金屬蛋白酶-1；MMP-2 為基質(zhì)金屬蛋白酶-2；MMP-9 為基質(zhì)金屬蛋白酶-9；MMP-13 為基質(zhì)金屬蛋白酶-13；TIMP-1為基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1；TIMP-2 為基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；GAPDH 作為內(nèi)參，結(jié)果以mRNA/GAPDH 比率表示；與對(duì)照組比較，aP＜0.05

圖2 兩組縮窄性心包炎患者心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達(dá)

表3 兩組縮窄性心包炎患者心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達(dá)水平比較（）

表3 兩組縮窄性心包炎患者心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達(dá)水平比較（）

注：對(duì)照組給予常規(guī)方案治療；真武湯組常規(guī)治療基礎(chǔ)上加真武湯治療；TGF-β1 為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；p-Smad2 為磷酸化Smad 蛋白2；p-Smad3 為磷酸化Smad 蛋白3；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與對(duì)照組比較，aP＜0.05

4 討論

真武湯在臨床上常用于治療陽(yáng)虛水泛證候，臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，真武湯及其衍生組方具有強(qiáng)心、利尿、減輕心肌纖維化、消除自由基、改善心功能等療效[7-8]。本實(shí)驗(yàn)將真武湯應(yīng)用于縮窄性心包炎圍術(shù)期的聯(lián)合治療，結(jié)果表明，真武湯組患者NT-proBNP及LVEDD、LVESD、LVEF 等心功能指標(biāo)較對(duì)照組明顯改善（P＜0.05），其臨床療效得到證實(shí)。有文獻(xiàn)顯示，縮窄性心包炎發(fā)病基礎(chǔ)是病理性組織重塑，表現(xiàn)為纖維組織增生、玻璃樣變性、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、心包鈣化等[9]。亦有研究證實(shí)，纖維化是心包縮窄的始發(fā)因素，其病理特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分的增加，包括Collagen、Elastin、纖維連接蛋白和層粘連蛋白等[10]。本實(shí)驗(yàn)中，HE 染色顯示縮窄性心包炎患者心包組織膠原纖維含量增多、彈性纖維減少，并出現(xiàn)纖維斷裂、玻璃樣變性等組織重塑特征，而真武湯組心包組織纖維化程度有所減輕，提示真武湯可能改善心包組織纖維化。

心包組織纖維化的直接原因是由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物（TIMPs）失衡介導(dǎo)的ECM 平衡失調(diào)。MMPs 是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的細(xì)胞外鋅內(nèi)切肽酶，已知它們能夠切割ECM 的多種成分[11]，可促進(jìn)纖維膠原降解，能被特定的TIMPs 所抑制[12]。MMPs/TIMPs 比例異常降低將導(dǎo)致ECM 組分合成和沉積增加，降解減少，MMPs 被認(rèn)為是病理?xiàng)l件下組織重構(gòu)的關(guān)鍵因素。而TIMPs 是一種特異的內(nèi)源性抑制劑，對(duì)MMPs 的活動(dòng)進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控，防止基質(zhì)過(guò)度退化[13]。其中MMP-2，MMP-9 又稱Ⅳ型膠原酶，可增加Collagen/Elastin 比率，引起ECM 沉積；而MMP-1，MMP-8，MMP-13 具有抗纖維化作用，有研究證實(shí)其過(guò)表達(dá)可抑制膠原沉積，改善組織纖維化[14]。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)RT-qPCR驗(yàn)證真武湯組心包組織Collagen I 和Collagen Ⅲ表達(dá)量較對(duì)照組有所降低，而Elastin 表達(dá)量相對(duì)增高（P＜0.05）。另外比較于對(duì)照組，真武湯組心包組織MMP-2/TIMP-2 和MMP-9/TIMP-1 的比值有所降低，MMP-1/TIMP-1 和MMP-13/TIMP-1 的比值顯著增高（P＜0.05），表明真武湯可有效調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）是ECM 成分表達(dá)和纖維化發(fā)展的主要調(diào)節(jié)因子，其中TGF-β1 是心臟成纖維細(xì)胞活化和纖維化的重要介質(zhì)[15-16]。相關(guān)研究顯示，在不同類型心包炎患者心包液和血漿轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 水平的升高與膠原合成增加有關(guān)[17-18]。在經(jīng)典的TGFβ 信號(hào)通路中（Smad 依賴性），TGF-β 信號(hào)主要由Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體介導(dǎo)[19]，TGFβ 受體的活化導(dǎo)致Smad2/3（即TGF-β 亞家族的Receptor-regulated Smad，R-Smad）的磷酸化。隨后活化的R-Smad 與Co-mediator Smad（Co-Smad，即Smad4）形成異構(gòu)體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，進(jìn)一步調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[20-21]。本研究Western blot 證實(shí)真武湯組心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 水平較對(duì)照組有所降低，表明真武湯可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smads 信號(hào)通路調(diào)節(jié)下游纖維化相關(guān)基因表達(dá)水平改善心包纖維化。

綜上所述，真武湯可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1/Smads信號(hào)通路調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs 平衡，阻止ECM 沉積，抑制心包組織纖維化，從而改善縮窄性心包炎患者的圍術(shù)期心功能。