表面修飾探針納升電噴霧質(zhì)譜脂質(zhì)組學(xué)對大型溞和蚤狀溞的快速鑒別

鄧潔薇，楊運(yùn)云，林 里，欒天罡，

（1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院,廣州510006；2.廣東省科學(xué)院,廣東省測試分析研究所(中國廣州分析測試中心),廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程技術(shù)中心,廣州510070；3.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心,廣州510275）

溞屬（Daphnia）生物是一類枝角類淡水浮游動物，體長在0.2～5.0 mm之間，生活在沼澤、池塘、湖泊及河流等多種水環(huán)境中［1］. 溞屬生物屬于一類重要的淡水浮游動物，在水生生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的能量和養(yǎng)分輸送作用，常用作生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)和環(huán)境科學(xué)研究的模式生物［2，3］. 大型溞（Daphnia magna）和蚤狀溞（Daphnia pulex）是Daphnia的2大類最常見物種，它們的形態(tài)特征非常相似，肉眼難以區(qū)分. 傳統(tǒng)的Daphnia物種鑒定是基于顯微鏡或電子顯微鏡的形態(tài)學(xué)觀察，操作簡便直觀，但需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專家對細(xì)微的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行識別和鑒定，并且存在細(xì)微差異的近緣種或者近似種因形態(tài)特征相似而難以鑒別區(qū)分［4］. 近年來，基于分子生物學(xué)［4，5］和蛋白組學(xué)［6，7］的生物鑒定方法得到迅速發(fā)展，這對形態(tài)特征極其相似的近緣種或近似種等生物的分類起到了積極作用. 然而，這些方法操作繁瑣，需要多步驟樣品處理，無法實(shí)現(xiàn)物種的快速識別和分類. 因此，開發(fā)快速、可靠的生物分子鑒定與分類方法具有重要意義.

脂質(zhì)是生物體的重要活性化學(xué)物質(zhì)，在細(xì)胞膜組成、能量儲存和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物功能中發(fā)揮著重要作用［8］. 生物體具有獨(dú)特的脂類特征，特定的脂類組學(xué)信息與生理或病理狀態(tài)下的各種生物過程有關(guān). 這些分子特征可為深入了解與脂質(zhì)組成相關(guān)的生物學(xué)功能以及生物種屬鑒定提供重要依據(jù). 質(zhì)譜（MS）具有靈敏度高、選擇性好、特異性好及信息豐富等優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)研究的主流技術(shù)手段［9～11］. 近年來，常壓敞開式質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，該技術(shù)具有原位、實(shí)時、直接、快速和高通量分析的特點(diǎn)，為常壓敞開環(huán)境條件下的直接生物脂質(zhì)分析和組學(xué)研究提供了重要手段［12，13］. 如，Cooks等［14］利用解吸電噴霧電離質(zhì)譜（DESI-MS）分析了人腦膠質(zhì)瘤和腦實(shí)質(zhì)的脂質(zhì)代謝特征；Vertes 等［15］利用激光燒蝕電噴霧離子化質(zhì)譜（LAESI-MS）研究了非洲爪蟾卵細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的磷脂組成與差異；Liu等［16］采用常壓敞開式聲波噴霧離子化質(zhì)譜（EASI-MS）技術(shù)研究了不同生長周期活體藻類細(xì)胞中脂質(zhì)化合物的變化和組成差異；Quyang 等［17］利用液滴微連接表面采樣探針質(zhì)譜（LMJ-SSP-MS）技術(shù)分析了大鼠不同組織器官中脂質(zhì)化合物及雙鍵異構(gòu)體的分布差異；Abliz等［18］利用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化質(zhì)譜（AFADESI-MS）研究了原生狀態(tài)下的腫瘤相關(guān)脂質(zhì)代謝物和代謝酶.

表面修飾探針納升電噴霧質(zhì)譜（SCP-nanoESI-MS）是本課題組針對生物微尺度、原位、活體脂質(zhì)組學(xué)分析開發(fā)的一種固相微萃取與敞開式納升電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，其通過制備對脂質(zhì)化合物具有高富集能力的微尺度表面修飾探針，實(shí)現(xiàn)了小型生物甚至單細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)化合物的高效萃取和敞開式納升電噴霧質(zhì)譜分析［19～21］.

本文采用SCP-nanoESI-MS 技術(shù)，對Daphnia屬D. magna和D. pulex個體進(jìn)行直接、原位、快速質(zhì)譜分析，建立了2種Daphnia的脂質(zhì)指紋圖譜，并進(jìn)行了脂質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法分析實(shí)現(xiàn)了D. magna和D. pulex的區(qū)分，為生物物種快速鑒別提供了新的技術(shù)手段.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲醇和氯仿（色譜純，美國Burdick＆Jackson 公司）；二水氯化鈣、二水硫酸鎂、碳酸氫鈉、氯化鉀、高錳酸鉀、重鉻酸鉀和氫氧化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；二甲基十八烷基［3-（三甲氧基硅基）丙基］氯化銨（50%甲醇溶液，德國Fluorochem 公司）；殼聚糖（分子量326700）和三聚磷酸鈉（美國Sigma-Aldrich公司）；實(shí)驗(yàn)用水為美國Mili-Q公司超純水儀制備的超純水.

LTQ-Orbitrap Elite 型線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；Sarix X 7T FT-ICR型傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（德國Bruker Daltonics公司）；三維移動平臺（北京卓立漢光儀器有限公司）；DM IL型倒置顯微鏡（德國Leica Microsystems 公司）；BG12-94-4-N-20型納升電噴霧針（美國New Objective公司）.

1.2 表面修飾探針的制備

參照文獻(xiàn)［20］方法，采用RS-6065 型顯微解剖鎢針制作表面修飾探針：先用甲醇/水溶液（體積比1∶1）將顯微解剖鎢針的表面清洗干凈，然后置于含30 g/L 高錳酸鉀和15 g/L 重鉻酸鉀的30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硫酸溶液中，于90 ℃加熱回流24 h. 將鎢針取出，用超純水洗滌干凈，置于30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的氫氧化鈉溶液中，于90 ℃加熱回流24 h，使其表面羥基化. 將表面羥基化的鎢針浸入50 mL無水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入2.5 mL 二甲基十八烷基［3-（三甲氧基硅基）丙基］氯化銨，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于120 ℃加熱回流反應(yīng)12 h. 然后，將探針浸入20 mL 殼聚糖溶液（4 mg/mL，溶于2%乙酸）中超聲30 min，向體系中繼續(xù)加入10 mL三聚磷酸鈉溶液（0.5 mg/mL）超聲1 h. 反應(yīng)完成后，取出探針，用甲醇沖洗干凈，晾干后即得表面修飾探針，置于干凈試管中待用.

1.3 Daphnia培養(yǎng)

D. magna購自廣州市微生物研究所，D. pulex由寧波大學(xué)贈送，二者均為本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)三代以上的單克隆品系.D. magna和D. pulex采用靜水式培養(yǎng)，于人工淡水（1000 mL 超純水中加入58.5 mg二水氯化鈣、24.7 mg二水硫酸鎂、13.0 mg碳酸氫鈉和1.2 mg氯化鉀，曝氣24 h）中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（20±1）℃，光暗比16∶8，每天喂食淡水藻（Scenedesmus subspicatus）2次.

1.4 采 樣

使用制備的表面修飾探針進(jìn)行采樣和萃取. 在倒置顯微鏡觀察下，用精密三維操作臺控制探針精確地插入到D. magna或D. pulex的腹部進(jìn)行采樣和萃?。⊿cheme 1），采樣深度為50 μm，采樣時間為60 s. 采樣結(jié)束后，將探針從D. magna或D. pulex體內(nèi)取出，放入純水中清洗10 s，自然晾干后，待分析.

Scheme 1 Schematic diagram for analysis of D. magna and D. pulex by SCP?nanoESI?MS

1.5 微萃取探針納升電噴霧質(zhì)譜分析

使用微量注射器將1 μL解吸/噴霧溶劑加入到一支納升電噴霧針的尖端位置. 將萃取后的微尺度表面修飾探針裝載到納升電噴霧針中，使探針的尖端置于解吸/噴霧溶劑中進(jìn)行脂質(zhì)化合物的解吸，解吸時間為30 s. 隨后，將表面修飾探針與納升電噴霧針一起安裝到三維移動臺上，使納升電噴霧針的尖端對準(zhǔn)質(zhì)譜入口并距離質(zhì)譜入口5 mm. 施加+3.0 kV高壓電場于探針上，誘導(dǎo)解吸/噴霧溶劑產(chǎn)生納升電噴霧離子化進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析.

質(zhì)譜分析采用LTQ-Orbitrap-MS（分辨率約為1.2×105）和FT-ICR-MS（4M 記錄模式，質(zhì)量分辨率約2×105）進(jìn)行. 離子傳輸管溫度300 ℃；鞘氣和輔氣均為0 arb；質(zhì)譜記錄采用全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍為m/z200～1200. 多級質(zhì)譜分析采用LTQ-Orbitrap-MS的高能碰撞解離（HCD）進(jìn)行. 儀器控制和數(shù)據(jù)處理采用Xcalibur 2.2和FT-MS control軟件.

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

將質(zhì)譜圖扣除背景信號和同位素峰，脂質(zhì)化合物采用精確質(zhì)量數(shù)（質(zhì)量數(shù)誤差<0.005 Da）和二級質(zhì)譜離子碎片信息進(jìn)行鑒定，并結(jié)合脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//lipid MAPS.org）進(jìn)行比對；統(tǒng)計分析采用Microcal Origin 8.0 軟件（美國Northampton 公司）；主成分分析采用SIMCA-P 11.5 軟件（瑞典Umetrics公司）.

2 結(jié)果與討論

2.1 SCP?nanoESI?MS分析D.magna和D.pulex的脂質(zhì)指紋圖譜

SCP-nanoESI-MS 分析D. magna和D. pulex的過程如Scheme 1 所示. 實(shí)驗(yàn)采用的微尺度表面修飾探針的基體是尖端為1 μm的顯微解剖鎢探針，經(jīng)表面羥基化和硅烷化修飾上對脂質(zhì)化合物具有高選擇性和高富集能力的涂層材料，再經(jīng)離子凝膠化在探針表面進(jìn)一步修飾上殼聚糖聚合物外層，以提高探針的生物相容性，所獲得的微尺度表面修飾探針的尖端直徑小于5 μm，非常有利于對單個小型生物微尺度的原位萃取采樣［20］. 該探針對復(fù)雜生物樣品中的長鏈脂質(zhì)化合物如磷脂酰膽堿（PC）和甘油三酯（TAG）具有選擇性吸附能力，對不同PC的富集能力達(dá)100～300倍，且具有良好的生物相容性和抗干擾能力，可重復(fù)使用100次以上.

實(shí)驗(yàn)采用的D. magna和D. pulex大小為3～5 mm，制備的探針可以實(shí)現(xiàn)對單個小型水生生物的原位萃取和采樣及脂質(zhì)組學(xué)研究. 本文采用微尺度表面修飾探針從Daphnia體內(nèi)進(jìn)行脂質(zhì)化合物的萃取和富集，然后在常壓敞開條件下，通過直接nanoESI-MS分析探針上富集的脂質(zhì)，并實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)種類和結(jié)構(gòu)的鑒定. 前文［20］曾探討過D. magna不同部位（腹部、頭部、背部和尾部）脂質(zhì)的組成差異，結(jié)果表明，D. magna腹部的脂質(zhì)最豐富，含量也最高，其次是背部、頭部及尾部. 因此，本文選擇腹部作為采樣點(diǎn).

對D. magna和D. pulex腹部的脂質(zhì)進(jìn)行了SCP-nanoESI-MS 分析［圖1（A）和（B）］，發(fā)現(xiàn)D. magna和D. pulex的脂質(zhì)指紋圖譜非常相似，在m/z700～950 范圍內(nèi)均可觀察到豐富的脂質(zhì)化合物信號，以m/z778.5344，782.5657，804.5511，843.6456，859.6194，873.6917，889.6660，899.7086 和915.6817等高豐度的離子信號為主.

Fig.1 Lipidomic fingerprints of D. magna(A)and D. pulex(B)

對于脂質(zhì)化合物的鑒定，可通過高分辨質(zhì)譜的一級精確質(zhì)量數(shù)（絕對誤差≤0.005 Da）和脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析來推導(dǎo)可能的分子式，結(jié)合二級質(zhì)譜離子碎片信息鑒定脂質(zhì)化合物的不飽和度和脂肪酸鏈組成. 如，質(zhì)量數(shù)為m/z778.5370 的離子，經(jīng)LIPID MAPS 數(shù)據(jù)庫搜索為C42H78NO8PNa（［PC（34∶3）+Na］+，δ1.64）或C44H77NO8P（［PC（36∶6）+H］+，δ―1.45）. 對該離子進(jìn)行HCD實(shí)驗(yàn)，在獲得的二級質(zhì)譜圖中可觀察到3 個高豐度的碎片離子（圖2）.m/z719.4618 和595.4683 的碎片離子分別對應(yīng)于N（CH3）3和C2H5PO4的連續(xù)丟失，表明存在PC 類磷脂酰膽堿的基團(tuán)；m/z573.4873 碎片離子與m/z595.4683的質(zhì)量差為22，對應(yīng)于在m/z595.4683處的鈉離子丟失和氫離子加合，提示m/z778.5370是［PC（34∶3）+Na］+而不是［PC（36∶6）+H］+. 此外，在其二級質(zhì)譜圖中還可以觀察到一系列低豐度的碎片離子.m/z478.3284 和500.3137 碎片離子對應(yīng)于［PC（34∶3）-C（18∶3）］+和［PC（34∶3）-C（16∶0）］+，m/z441.2376和463.2220碎片離子對應(yīng)于［M+Na-N（CH3）3-FA（18∶3）］+和［M+Na-N（CH3）3-FA（16∶0）］+，m/z239.2367和261.2208碎片離子分別對應(yīng)為［FA（16∶0）-H2O］+和［FA（18∶3）-H2O］+，均表明該脂質(zhì)化合物由C（16∶0）和C（18∶3）2 條脂肪鏈組成，由此可鑒定m/z778.5370 的結(jié)構(gòu)為［PC（16∶0_18∶3）+Na］+.

Fig.2 MS/MS spectrum of m/z 778.5352

D.magna和D.pulex的脂質(zhì)鑒定結(jié)果列于表1，可見，二者的脂質(zhì)指紋圖譜主要包含PC和TAG 2大種類，且多為鈉/鉀加合物信號，這是由于生物體內(nèi)含有大量的鈉/鉀鹽，脂質(zhì)可以以鈉/鉀加合物的形式穩(wěn)定存在.此外，D.magna和D.pulex的脂質(zhì)化合物種類和脂質(zhì)化合物脂肪鏈組成的比例存在一定差異：D.magna的脂質(zhì)以PC（16∶0_16∶1），PC（16∶0_18∶3），PC（18∶2_18∶2），TAG（16∶0_16∶4_18∶3），TAG（16∶0_16∶1_20∶5）和TAG（18∶1_18∶3_18∶3）等為主；D. pulex的脂質(zhì)以PC（16∶0_16∶1），PC（16∶0_18∶1），PC（18∶2_18∶2），TAG（16∶0_16∶1_18∶3），TAG（16∶0_16∶1_20∶4）和TAG（18∶1_18∶3_18∶3）等為主［圖1（A）和（B）］.

Table 1 List of the identified lipids from D.magna and D.pulex using SCP-nanoESI-MS

2.2 D.magna和D.pulex脂質(zhì)組成特征

由脂質(zhì)指紋圖譜和鑒定結(jié)果可知，在D. magna和D. pulex的脂質(zhì)組成中甘油三酯的豐度很高. 為研究其甘油三酯的組成特征，進(jìn)一步對20 只D. magna和20 只D. pulex進(jìn)行了SCP-nanoESI-MS 分析.m/z839.68，841.67，843.68，845.70，847.71，849.73，851.74 和853.77 的碎片離子分別對應(yīng)不同飽和度從9到2的各個C50甘油三酯［如TAG（50∶9）表示該甘油三酯中3條脂肪鏈的碳原子總數(shù)為50，雙鍵個數(shù)為9］，即TAG（50∶9），TAG（50∶8），TAG（50∶7），TAG（50∶6），TAG（50∶5），TAG（50∶4），TAG（50∶3）和TAG（50∶2）.m/z867.67，869.68，871.70，873.71，875.73和877.75的碎片離子分別對應(yīng)不同飽和度（從9 到4）的各個C52甘油三酯，即TAG（52∶9），TAG（52∶8），TAG（52∶7），TAG（52∶6），TAG（52∶5）和TAG（52∶4）. 由圖3可見，D. magna甘油三酯組成比例的不飽和度較高，C50甘油三酯中豐度最高的是不飽和度為7 的TAG（50∶7），C52甘油三酯中豐度最高的是不飽和度為6 的TAG（52∶6）［圖3（A）］；而D. pulex 甘油三酯組成的不飽和度比D. magna低，C50甘油三酯中豐度最高的是TAG（50∶4），C52甘油三酯中豐度最高的是TAG（52∶5）［圖3（B）］，提示D. magna和D. pulex 脂質(zhì)組成特征具有一定的規(guī)律性.

2.3 D.magna和D.pulex脂質(zhì)指紋圖譜模式識別分析

采用SIMCA-P統(tǒng)計分析軟件對D. magna和D. pulex樣本進(jìn)行了主成分分析，以脂質(zhì)化合物的質(zhì)譜相對豐度為變量，以D. magna和D. pulex樣本為觀察對象，原始數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，再對其進(jìn)行運(yùn)算. 主成分個數(shù)提取原則為主成分對應(yīng)的特征值大于1的前m個主成分. 從方差貢獻(xiàn)率來看，第一主成分貢獻(xiàn)率為48.67%，貢獻(xiàn)率最大，包含的信息最多；第二主成分貢獻(xiàn)率為20.02%；第三主成分貢獻(xiàn)率為11.84%. 前3個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到80.53%，基本能反映D. magna和D. pulex的基本特征. 分別以第一、第二和第三主成分來建立坐標(biāo)系，進(jìn)行投影即可得到所有樣本的PCA得分圖和載荷圖，結(jié)果如圖4所示. 由圖4（A）的PCA得分圖可見，D. magna（M1―M20）和D. pulex（P1―P20）的數(shù)據(jù)點(diǎn)得到了良好區(qū)分.D. magna和D. pulex能夠明顯地分為2大類，代表這2個物種的脂質(zhì)組成存在著顯著差異. 圖4（B）為PCA載荷圖，圖中每個點(diǎn)代表1個脂質(zhì)化合物. 脂質(zhì)化合物的系數(shù)絕對值在載荷圖中得分越高，代表該化合物對樣品分類所起的作用越大. 由圖4（B）可見，m/z841.63，843.65，873.69和871.68，這4個離子與D. magna分布呈正相關(guān)，而m/z847.68，849.69，877.72和875.71這4個離子與D. pulex分布呈正相關(guān)，表明這些脂質(zhì)是區(qū)分D. magna和D. pulex的潛在生物標(biāo)記物.

Fig.4 PCA score plot(A)and loading plot(B)of D. magna and D. pulex

3 結(jié) 論

采用SCP-nanoESI-MS技術(shù)對Daphnia屬D. magna和D. pulex個體進(jìn)行直接、快速、原位質(zhì)譜分析和脂質(zhì)組學(xué)研究，建立了2種Daphnia屬生物的脂質(zhì)指紋圖譜，并進(jìn)行了脂質(zhì)標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)鑒定. 采用該方法獲得了大型溞和蚤狀溞的脂質(zhì)指紋圖譜，并研究了二者體內(nèi)的脂質(zhì)組成特征，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)手段實(shí)現(xiàn)了二者的快速區(qū)分，鑒定了相關(guān)的脂質(zhì)生物標(biāo)志物. 由此可見，基于SCP-nanoESI-MS的脂質(zhì)組學(xué)方法適用于Daphnia屬D. magna和D. pulex的快速識別和鑒定.