共晶誘導(dǎo)增強的電化學(xué)發(fā)光9,10-二苯基蒽-苝微晶構(gòu)建高效尿酸傳感器

廖 妮，張捷源，黃梓陽，趙晏汐，柴雅琴，袁 若，卓 穎

（發(fā)光分析與分子傳感教育部重點實驗室(西南大學(xué)),西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶400715）

尿酸（UA）是人體內(nèi)嘌呤核苷酸代謝的主要產(chǎn)物，人尿液中UA 異常與痛風(fēng)、高尿酸血癥、Lesch-Nyhan綜合征、心血管疾病和腎臟疾病等密切相關(guān)［1，2］. 因此，準(zhǔn)確、快速地檢測UA對疾病診斷及相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防具有重要意義. 電化學(xué)發(fā)光（ECL）分析技術(shù)兼具電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光分析的優(yōu)點，其靈敏度高、背景噪聲小、動態(tài)響應(yīng)范圍廣、可控性強且響應(yīng)快速，在臨床檢驗、食品安全及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用價值［3～5］. 在眾多的ECL材料中，多環(huán)芳烴有機發(fā)光體因生產(chǎn)成本低、物理及化學(xué)穩(wěn)定性好、結(jié)構(gòu)可控和量子產(chǎn)率高等特點而備受關(guān)注［6，7］. 然而，這類發(fā)光體通常需要在其良溶劑（非極性溶劑）中才能實現(xiàn)電化學(xué)發(fā)光，而在水相體系中平面型多環(huán)芳烴容易發(fā)生π?π聚集而產(chǎn)生誘導(dǎo)猝滅（ACQ）效應(yīng)［8］. 因此，如何減少或克服平面芳香環(huán)結(jié)構(gòu)有機發(fā)光體的ACQ 效應(yīng)，實現(xiàn)其在水相體系中高強度的ECL是當(dāng)前生物分析面臨的重大挑戰(zhàn).

苝（Pe）作為一種典型的平面共軛芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的有機發(fā)光分子，因具有較高的量子效率（約90%）［9］及優(yōu)異的光化學(xué)性質(zhì)而受到廣泛關(guān)注［10］. 同時，平面芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的Pe分子容易通過π?π作用在界面有序組裝，是修飾電極界面理想的ECL 材料. 然而，平面分子Pe的ACQ 效應(yīng)卻導(dǎo)致電極界面Pe聚集體的ECL響應(yīng)顯著降低. 近年來，為了克服這種ACQ效應(yīng)，Zhao等［11］將非共平面分子（如四苯基乙烯等）修飾在苝環(huán)的海灣區(qū)域，成功將典型的ACQ分子轉(zhuǎn)換成聚集誘導(dǎo)增強的發(fā)光分子，使其在聚集狀態(tài)下實現(xiàn)強的熒光信號. 盡管該方法克服了平面型Pe分子聚集時的ACQ效應(yīng)，但是其合成過程復(fù)雜、分離提純難度大且難以推廣. 因此，探尋一種簡便的方法減少Pe分子的ACQ效應(yīng)，并實現(xiàn)在水相中明顯增強的ECL響應(yīng)尤為重要.

本文采用表面活性劑輔助自組裝方法［12］，選取非共平面的9，10-二苯基蒽（DPA）分子與平面型Pe分子在水相中自組裝，一步合成了DPA-Pe共晶微米顆粒（DPA-Pe MCs）. 非共平面的DPA分子較大的空間位阻能夠有效抑制晶體中Pe 分子的π?π緊密堆積，從而通過改變Pe 排列方式有效消除ACQ 效應(yīng). 同時DPA 分子還發(fā)揮著供體分子的作用，為受體分子Pe 提供了有效的能量傳遞，進一步增強了ECL 響應(yīng). 因此，我們將DPA-Pe MCs 出現(xiàn)的這一現(xiàn)象定義為共晶誘導(dǎo)增強電化學(xué)發(fā)光，并對DPAPe MCs的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)機理進行了研究. 基于UA能夠有效猝滅DPA-Pe MCs在三乙胺（TEA）作為共反應(yīng)試劑（DPA-Pe MCs/TEA）體系的ECL 信號，我們將DPA-Pe MCs 修飾到電極表面構(gòu)建了高靈敏UA傳感器，并對其線性響應(yīng)、選擇性和穩(wěn)定性進行了研究.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

苝（Pe，純度>98%）購于東京化學(xué)工業(yè)有限公司；9，10-二苯基蒽（DPA，純度98%）和四氫呋喃（THF，分析純）均購于上海百靈威科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和三乙胺（TEA）均為分析純，由科隆化學(xué)試劑廠提供；UA（純度>98%）購自美國Sigma-Aldrich公司.

利用MPI-A ECL 分析儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）進行ECL 測量；由參比電極Ag/AgCl（飽和KCl）、輔助電極鉑絲和工作電極玻碳電極（GCE，?=4 mm）組成三電極體系；使用S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）表征DPA-Pe MCs的微觀形貌；采用RF-5301PC型熒光光度儀（日本島津儀器公司）表征材料的熒光性質(zhì)；采用實驗室自主搭建的ECL 光譜系統(tǒng)測試不同發(fā)光材料的ECL 光譜，該系統(tǒng)主要包括Vertex 電化學(xué)工作站（荷蘭Ivium 公司）、Kymera 193i 型光譜儀和EMCCD 光譜（美國Andor公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 9，10-二苯基蒽-苝共晶（DPA-Pe MCs）的制備 將5 mg DPA粉末和5 mg Pe粉末加入5 mL THF中劇烈攪拌至溶解，獲得均勻的DPA 和Pe 混合溶液（1 mg/mL）. 將該混合物加入10 mL 15 mmol/L CTAB水溶液中攪拌20 min，離心洗滌收集DPA-Pe MCs沉淀. 用去離子水多次洗滌、離心沉淀，以除去游離的THF 和CTAB. 最后，將沉淀超聲分散在10 mL 去離子水中，備用. DPA-Pe MCs 的制備過程如Scheme 1所示. 苝微晶（Pe MCs）按照上述合成步驟中不加入DPA粉末合成（Pe粉末10 mg）. 9，10-二苯基蒽微晶（DPA MCs）按照上述合成步驟中不加入Pe粉末合成（DPA粉末10 mg）.

Scheme 1 Preparation process of DPA-Pe MCs

1.2.2 電化學(xué)發(fā)光尿酸傳感器的制備 分別用0.3和0.05 μm氧化鋁粉末對玻碳電極進行打磨拋光，然后依次用乙醇和超純水超聲處理. 將處理好的電極在室溫下自然晾干. 將10 μL DPA-Pe MCs水溶液滴涂在干凈的GCE 表面，自然晾干成膜得到尿酸傳感器（DPA-Pe MCs/GCE），置于4 ℃冰箱中，備用.對比實驗中分別采用10 μL DPA MCs和10 μL Pe MCs修飾經(jīng)預(yù)處理的GCE，得到不同微晶修飾的電極（分別縮寫為DPA MCs/GCE和Pe MCs/GCE）.

1.2.3 電化學(xué)發(fā)光測試 測試底液為含有18 mmol/L TEA 的2 mL 0.1 mol/L PBS 緩沖溶液（pH=7.4）.10 mmol/L UA 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將一定量的UA粉末溶解于1 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液中，再用酸性的0.1 mol/L NaH2PO4溶液調(diào)節(jié)UA溶液的pH約為7.0，備用. 不同濃度的UA標(biāo)準(zhǔn)溶液采用測試底液稀釋10 mmol/L UA 標(biāo)準(zhǔn)溶液得到. ECL 測試參數(shù)：光電倍增管高壓600 V，掃描速率300 mV/s，電壓范圍0～1.4 V.

2 結(jié)果與討論

2.1 DPA-Pe MCs 的表征

圖1（A）是DPA-Pe MCs 的SEM 照片，可見DPA-Pe MCs 呈現(xiàn)較為均勻且表面光滑的方塊狀結(jié)構(gòu).DPA-Pe MCs的XRD譜圖如圖1（B）所示，可見強而清晰的衍射峰（譜線a），表明其具有高度的結(jié)晶性.通過與標(biāo)準(zhǔn)卡片中的Pe 晶體［CCDC code PERLEN05，圖1（B）譜線b］和DPA 晶體［CCDC code DPAN?TR01，圖1（B）譜線c］進行對比發(fā)現(xiàn)，DPA-Pe MCs的特征衍射峰與二者均不相同，說明引入DPA的Pe微晶形成了新的晶格，是一種新的共晶結(jié)構(gòu).

Fig.1 SEM image(A) and XRD patterns(B) of DPA?Pe MCs(a), the standard PDF cards of Pe(b) and DPA(c)crystals

2.2 不同修飾電極的電化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)性能

采用電化學(xué)發(fā)光和循環(huán)伏安（CV）法研究了不同微晶修飾電極的性能. 如圖2（A）所示，裸GCE在測試底液中未觀察到ECL信號（曲線a）. Pe MCs/GCE在測試底液中ECL響應(yīng)強度為4347 a.u.（曲線b），說明Pe MCs 在水相介質(zhì)中也具有一定的ECL 響應(yīng). DPA MCs/GCE 在測試底液中ECL 響應(yīng)強度為8826 a.u.（曲線c），這是由于非共平面的DPA分子具有聚集誘導(dǎo)增強ECL效應(yīng)［13］. 在相同的測試條件下DPA-Pe MCs/GCE 的ECL 顯著增加，ECL 強度最高達16332 a.u.（曲線d），分別比Pe MCs/GCE 和DPA MCs/GCE 的ECL 強度提高了3.76 倍和1.85 倍，表明DPA 分子的引入可使DPA-Pe MCs 的ECL 顯著增強. 圖2（B）為對應(yīng)修飾電極的循環(huán)伏安（CV）曲線，可見，由于測試溶液中缺少氧化還原電對，裸GCE（曲線a）無明顯的CV峰；Pe MCs/GCE在0.96 V處觀察到明顯的氧化峰而沒有還原峰（曲線b），其呈現(xiàn)不可逆CV行為；DPA MCs/GCE在電位上限處（1.4 V）的電流值最大，但未見明顯平臺值（曲線c），說明DPA MCs 氧化峰電位可能超出該電化學(xué)窗口. 與Pe MCs/GCE 相比（曲線b），DPA-Pe MCs/GCE 的氧化峰電流值明顯增強，且峰電位值正移到1.24 V（曲線d）. 此現(xiàn)象可能歸因于以下2點：（1）當(dāng)DPA引入Pe MCs 中時，DPA-Pe MCs 中的氧化還原物質(zhì)與Pe MCs 中并不相同，其具有更正的氧化電勢；（2）在DPA-Pe MCs 中，發(fā)生氧化的物質(zhì)數(shù)量明顯增多，使得其峰電流顯著增加. 這也進一步說明DPA-Pe MCs/GCE的ECL增強與DPA-Pe MCs中參加氧化反應(yīng)的物質(zhì)明顯增多相關(guān).

Fig.2 ECL intensity of different MCs modified GCE in blank solution(A) and cyclic voltammograms of different MCs modified GCE in 0.1 mol/L PBS containing 0.7 mol/L [bmim][BF4] as sup?porting electrolyte(B)

2.3 DPA-Pe MCs 的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)機理

采用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜和ECL發(fā)射光譜探究了DPA-Pe MCs 的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)機理.已有文獻［14］指出，當(dāng)物質(zhì)A的發(fā)射光譜與物質(zhì)B的吸收光譜重疊大于30%時二者間就可能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，從而增強物質(zhì)B的ECL. 如圖3（A）所示，Pe MCs的紫外-可見吸收光譜（譜線a）與DPA MCs的發(fā)射光譜（譜線b）明顯重合，表明在DPA-Pe MCs中Pe與DPA之間可能存在能量轉(zhuǎn)移. 由于DPA分子具有較高的三重態(tài)能級ET1和單線態(tài)能級ES1［15，16］，而Pe 分子具有較低的三重態(tài)能級ET1和單線態(tài)能級ES1［17，18］，因此有理由推測DPA 在共晶中作為供體而Pe 作為受體. 利用熒光（FL）和ECL 發(fā)射光譜分別研究了DPA-Pe MCs 的光學(xué)性質(zhì). 為了得到分散態(tài)的Pe 分子，將Pe 粉末溶解于其良溶劑THF 中，在475 nm 處得到Pe 單體分子的熒光特征發(fā)射［圖3（B）譜線a］. 而水相中Pe MCs 的熒光（FL）光譜［圖3（B）譜線b］在550 nm處顯示出特征發(fā)射峰，在508 nm處顯示出1個較弱的肩峰，該FL譜線和文獻［19］描述的曲線輪廓及特征峰位置一致. 與分散態(tài)的Pe分子熒光特征發(fā)射相比，純Pe MCs 的熒光特征發(fā)射峰明顯紅移. 初步推測可能是由于苝微晶中Pe分子強的π?π堆積作用使得苝分子以二聚體或多聚體的形式存在所致. 當(dāng)形成DPA-Pe MCs 時，在490 nm 處觀察到最強FL 發(fā)射峰［圖3（B）譜線c］，該FL發(fā)射特征波長及FL的輪廓與分散狀態(tài)下Pe分子更為接近，表明DPA分子的引入可以有效抑制晶體中Pe聚集體的生成. 從圖3（C）可以看出，形成DPA-Pe共晶后，其熒光發(fā)射（譜線c）明顯強于Pe MCs的熒光發(fā)射（譜線b），說明共晶誘導(dǎo)增強效應(yīng)在DPA-Pe MCs熒光發(fā)射中同樣存在.

Fig.3 UV?Vis absorption spectra of Pe MCs(a) and ECL spectra of DPA MCs(b) in an aqueous solu?tion(A);normalized FL emission spectra of the Pe molecule in THF(a),Pe MCs(b)and DPA?Pe MCs(c) in an aqueous solution(B); FL emission spectra of Pe MCs(b) and DPA?Pe MCs(c) in an aqueous solution(C); the maximum ECL emission peak of Pe MCs(D) and DPA?Pe MCs(E)via a 3D surface image; two?dimensional ECL emission peaks of DPA?Pe MCs(a) and Pe MCs(b)(F);the possible ECL mechanism of DPA?Pe MCs(G)

為了進一步研究DPA 的引入對DPA-Pe MCs ECL 的影響，對Pe MCs 和DPA-Pe MCs 的ECL 光譜進行了研究. Pe MCs的ECL光譜［圖3（D）］在600 nm處顯示出最強的ECL發(fā)射峰，這可能是由于強π?π堆積導(dǎo)致的Pe分子的聚集，因此得到的是Pe二聚體或多聚體的ECL. 而DPA-Pe MCs的最強ECL發(fā)射峰［圖3（E）］位于500 nm，與Pe MCs的ECL光譜相比藍移100 nm，與分散態(tài)的Pe單分子的發(fā)射更為接近（475 nm）. 圖3（F）示出了Pe MCs 和DPA-Pe MCs 的二維ECL 發(fā)射光譜圖，可見共晶的ECL 強度比Pe MCs增加了2.56倍. 因此可以推斷，共晶中的DPA分子可以減少Pe的ACQ效應(yīng)并使苝的ECL顯著增強. 綜上，我們推斷DPA-Pe MCs的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)機理如圖3（G）所示. 在DPA-Pe MCs中，非平面分子DPA的加入可以有效阻止Pe二聚體或多聚體激發(fā)態(tài)（1Pe2*）的生成，使得其ECL發(fā)射來自于Pe單體激發(fā)態(tài)（1Pe*）. 從而有效消除了Pe MCs中Pe分子因聚集造成的ACQ效應(yīng). 同時，由于DPA與Pe的能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，使得共晶中的DPA作為供體，將其能量有效傳遞給Pe，從而顯著增強其ECL. 因此，我們將在DPA-Pe共晶結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的這一現(xiàn)象定義為共晶誘導(dǎo)增強的電化學(xué)發(fā)光.

2.4 DPA-Pe MCs 的量子化學(xué)表征

采用密度泛函理論（DFT）對共晶中DPA 和Pe 最可能的分子構(gòu)型進行了計算模擬，結(jié)果如圖4 所示. 首先，從Pe和DPA 的分子結(jié)構(gòu)可以看出，Pe分子是二維平面結(jié)構(gòu)［圖4（A）］，而DPA 是非共平面結(jié)構(gòu)的分子且兩側(cè)的2個苯基位于蒽核的平面之外［圖4（B）］. 通過密度泛函理論計算，得到DPA和Pe分子間最佳作用力構(gòu)型的平面圖和透視圖分別如圖4（C）和（D）所示. 可見，DPA中的蒽核心平面與Pe平面平行，而DPA 兩側(cè)的2 個苯基幾乎垂直于Pe 平面. 通過降低密度梯度（RDG）分析可以推導(dǎo)出DPA-Pe共晶中DPA和Pe之間的非共價相互作用. 如圖4（E）所示，Pe的苝環(huán)結(jié)構(gòu)與DPA的蒽核之間以π-π相互作用為主（綠色區(qū)域），而在DPA 分子的2個苯基附近存在明顯的空間位阻效應(yīng)（紅色區(qū)域）.因此，在DPA-Pe MCs 中，DPA 和Pe 的π-π相互作用可使之有序組裝形成新的晶體結(jié)構(gòu)，而DPA 側(cè)鏈苯環(huán)的空間位阻效應(yīng)可以抑制共晶中Pe分子的聚集，使之以單體形式存在.

Fig.4 Molecular structures of Pe(A), DPA(B) and DPA/Pe in different perspectives(C, D) and RDG analysis for DPA/Pe(E)

2.5 電化學(xué)發(fā)光傳感器對UA的檢測

由于UA能有效猝滅DPA-Pe MCs/TEA體系的ECL信號，根據(jù)ECL信號變化與UA濃度之間的關(guān)系可以實現(xiàn)對UA的定量檢測. 采用制備的DPA-Pe MCs修飾電極對不同濃度的尿酸進行了檢測，研究了該傳感器的線性響應(yīng)范圍、抗干擾能力和穩(wěn)定性. 如圖5（A）所示，當(dāng)UA 濃度從0.01 μmol/L 增加至5.0 mmol/L時，傳感器的ECL信號不斷減弱. 由圖5（A）中插圖可知，在此濃度范圍內(nèi)ECL信號的變化值（ΔI）與UA濃度（c）的對數(shù)（lgc）之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為ΔIECL=2153.7lgc―1671.9（其中，ΔI=Iblank―Ic），相關(guān)系數(shù)R=0.9973，檢出限為4.0 nmol/L（S/N=3）. 選擇性和穩(wěn)定性是傳感器的重要性能. 實驗選擇尿液中可能含有的金屬離子如和有機小分子如葡萄糖（Glucose）、尿素（Urea）、維生素C（C）、L-半胱氨酸（L-Cys）和L-組氨酸（L-His）作為潛在的干擾物質(zhì)，測試了該傳感器在含有2 mmol/L UA和5.0 mmol/L上述干擾物質(zhì)的測試底液中的ECL響應(yīng). 如圖5（B）和（C）所示，上述干擾物質(zhì)對所構(gòu)建的尿酸傳感器的ECL響應(yīng)無明顯影響，表明該傳感器具有較好的選擇性. 圖5（D）示出了在含有2.0 mmol/L UA的測試底液中該傳感器連續(xù)掃描10圈的ECL響應(yīng)情況. 可見，測試連續(xù)掃描10 圈所得ECL 信號的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.24%，說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性.

Fig.5 ECL responses of the UA sensor for different concentrations of UA(A),selective(B,C)and its stability(D)

3 結(jié) 論

利用非共平面DPA分子的空間位阻效應(yīng)來抑制Pe分子在晶體中的π?π緊密堆積，且DPA同時作為供體為發(fā)光分子Pe 提供有效的能量傳遞，顯著增強了DPA-Pe MCs 的ECL. 基于此，我們將DPAPe MCs的這種現(xiàn)象定義為共晶誘導(dǎo)增強ECL效應(yīng). 將DPA-Pe MCs用于構(gòu)建新型UA傳感器，其線性范圍為0.01 μmol/L～5.0 mmol/L，檢出限達到4.0 nmol/L. DPA-Pe MCs作為一類新型的ECL發(fā)光材料，有效解決了平面型多環(huán)芳烴有機發(fā)光體水溶性差及在固態(tài)或高濃度下緊密堆積導(dǎo)致發(fā)光猝滅等問題，為平面型多環(huán)芳烴有機發(fā)光體在傳感、成像及分子器件的進一步應(yīng)用開辟了新途徑.