熒光納米探針用于細胞器pH檢測的研究進展

公少華，張 霞，李 娜，唐 波

（山東師范大學化學化工與材料科學學院,分子與納米探針教育部重點實驗室,化學成像功能探針山東省高等學校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東師范大學分子與納米科學研究院,濟南250014）

pH是一項重要的生理參數(shù)，它涉及細胞內(nèi)吞、細胞增殖及離子轉運等多種生物學過程，并且多數(shù)蛋白功能的發(fā)揮也只有在一定的pH范圍內(nèi)才能進行［1，2］. 因此，pH穩(wěn)態(tài)對于活細胞的生物學過程以及細胞功能的發(fā)揮具有重要作用. 真核細胞內(nèi)部pH的分布是不均一的，這主要是因為真核細胞內(nèi)部存在不同的亞細胞器區(qū)室，這些亞細胞器以膜與周邊細胞質隔開并發(fā)揮特定的功能，而這些特定功能的發(fā)揮需要依賴細胞器pH穩(wěn)態(tài)［3，4］. 例如，細胞核的pH范圍為7.2～7.4，高爾基體的pH范圍為6.4～6.8，內(nèi)體和溶酶體的pH范圍為4.7～6.5，線粒體的pH≈8.0［5～8］. 細胞器pH穩(wěn)態(tài)的破壞會導致細胞器功能的紊亂，最終可能誘發(fā)相關疾?。?］. 例如，溶酶體pH的升高與溶酶體貯積癥有關，而免疫細胞成熟以及炎癥的發(fā)生則會伴隨溶酶體的酸化［10，11］. 線粒體pH 的紊亂與許多疾病的發(fā)生有關聯(lián)，如阿爾茲海默癥、雷氏癥候群、癌癥以及心血管疾病等［12，13］. 為了更好地闡明細胞器pH的變化在生理以及病理中的重要作用，發(fā)展有效的工具用于在亞細胞器水平上對pH的波動進行實時監(jiān)測至關重要.

目前已有多種方法可用于pH 的測定，如H+滲透微電極法、核磁共振波譜法以及光學顯微鏡法等［14］. 但是這些技術通常需要使用高精度的儀器，并且樣品的處理過程比較復雜，從而限制了其在活細胞水平上進行pH分析的應用. 熒光光譜分析具有響應速度快、信噪比高、非侵入及時空分辨率高的優(yōu)點［15，16］. 因此，熒光探針非常適合用于活細胞細胞質以及亞細胞器pH的檢測. 可以用于亞細胞器pH波動檢測的熒光探針類型較多，有熒光蛋白變異體、小分子熒光探針及熒光納米探針等. 熒光蛋白變異體的熒光發(fā)射在一定范圍內(nèi)受pH影響，因此可以用于在亞細胞器水平上對pH進行檢測［17，18］. 然而，這些熒光蛋白變異體需要進行轉染表達，增加了操作的復雜性，限制了其進一步應用［8］. 除熒光蛋白外，小分子熒光探針也可用于亞細胞器pH 波動的檢測. 近年來，靶向線粒體［18，19］、溶酶體［20，21］、內(nèi)質網(wǎng)［22，23］以及高爾基體［24，25］進行pH 檢測的分子熒光探針被相繼報道. 小分子熒光探針雖然能夠實現(xiàn)檢測，但其制備過程相對復雜，容易從細胞中外排，存在水溶性問題，有潛在的生物毒性［15，26～28］. 相對而言，熒光納米探針易于制備，靈敏度、特異性及靶向能力更好，并且可在納米顆粒上修飾多種熒光顏料分子，實現(xiàn)對多種分子的同時檢測［29，30］.

對于利用熒光探針進行pH成像的研究工作，2017年，Kim等［2］綜述了利用熒光探針對亞細胞器pH進行成像的研究進展，對小分子熒光探針的研究工作進行了全面、詳細的介紹，但對于熒光納米探針的研究工作涉及較少. 2019年，Barati等［31］總結了利用不同種類的納米傳感器對細胞pH進行成像的研究工作. 本綜述總結了近年來利用熒光納米探針在細胞器水平上對pH 進行定量檢測與成像的策略，并對該領域的前景以及所面臨的挑戰(zhàn)進行了展望.

1 細胞器pH檢測

1.1 線粒體pH檢測

線粒體是一種具有雙層膜結構的亞細胞器，在細胞能量代謝、氧化還原調節(jié)、信號通路、鈣離子穩(wěn)態(tài)和細胞凋亡中起關鍵作用［32，33］. 其中，線粒體pH對于線粒體功能的發(fā)揮十分關鍵，只有維持線粒體pH在一定范圍內(nèi)，才能使線粒體正常發(fā)揮功能. 線粒體pH失衡會導致線粒體功能紊亂，并可能最終引發(fā)阿爾茲海默癥、心血管疾病及癌癥等疾病［34，35］. 因此，實時監(jiān)測活細胞線粒體pH的變化對于深入研究相關疾病的致病機理十分重要.

1.1.1 基于硅納米顆粒的熒光納米探針 基于非侵入、高分辨檢測的優(yōu)勢，熒光納米探針非常適用于亞細胞器pH 的檢測. 熒光納米探針的制備需要以納米顆粒作為載體，其中，介孔二氧化硅納米顆粒（MNPs）具有良好的生物相容性、較高的負載能力，且其表面易修飾其它分子，適合作為熒光納米探針的載體［36］. 此外，熒光納米探針的設計還需要考慮檢測準確性的問題. 基于單發(fā)射熒光信號峰的熒光納米探針，其熒光信號容易受到探針濃度、激發(fā)條件、光漂白、環(huán)境和儀器條件等因素的影響. 相比之下，比率熒光探針可以產(chǎn)生2個不同發(fā)射波長的熒光信號，能夠有效減少外界因素的干擾，實現(xiàn)對pH的熒光定量檢測，提高檢測的準確性［37，38］. 為了實現(xiàn)線粒體內(nèi)pH的精準、定量測定，Tang等［39］發(fā)展了一種能夠靶向線粒體的比率熒光納米探針，他們選用介孔硅納米顆粒（MSNs）作為納米探針的載體，對其表面進行羧基化，進而修飾能對pH響應的氨基熒光素（AF，發(fā)射峰：515 nm）和作為參比單元的溴化乙錠（EB，發(fā)射峰：595 nm），形成MSNs-EB-AF. 為了防止染料的泄露以及進一步修飾線粒體靶向基團，在MSNs-EB-AF表面繼續(xù)包覆一層氨基化的介孔二氧化硅. 然后，進行線粒體靶向基團（4-羧丁基）溴化三苯基磷（TPP）的修飾，最終形成能夠靶向線粒體進行pH響應的比率熒光納米探針. 實驗結果表明，以488 nm作為激發(fā)波長，該比率熒光納米探針的熒光強度比在pH 5.0～8.3范圍內(nèi)與pH呈線性相關，在pH 4～9范圍內(nèi)能夠實現(xiàn)可逆變化. 在活細胞水平上，該探針能夠靶向線粒體. 在MCF-7細胞營養(yǎng)剝奪的條件下，利用該探針能夠檢測出線粒體pH的降低.

線粒體是細胞內(nèi)活性氧的主要產(chǎn)生部位，這些活性氧分子可以分為超氧陰離子自由基（）、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（?OH）等不同種類. 線粒體活性氧的失衡會導致細胞損傷，并且與許多疾病的發(fā)生密切關聯(lián). 線粒體活性氧的變化通常伴隨著線粒體pH的波動，因此同時檢測活性氧和pH的變化非常重要［40～42］. 為了實現(xiàn)在線粒體內(nèi)同時對H2O2和pH變化進行實時原位檢測，Tang等［43］發(fā)展了一種熒光納米傳感器. 該納米傳感器以介孔硅納米顆粒（MSN）作為載體，在其孔道內(nèi)裝載能夠分別檢測H2O2和pH 的分子熒光探針Cy-O-SeH 和熒光素，再利用靜電相互作用將聚乙烯亞胺（PEI）包覆在MSN表面，用于封閉MSN的孔道，防止分子熒光探針泄露. 最后，利用酰胺鍵作用將三苯基膦修飾到納米探針的表面，用于線粒體靶向. 實驗結果表明，該熒光納米探針可以靶向MCF-7活細胞線粒體，并且能在一定范圍內(nèi)實現(xiàn)對pH和H2O2波動的檢測（pH：5.3～8.2，H2O2：0～150 μmol/L）. 小分子藥物二氯乙酸鹽能夠抑制線粒體丙酮酸脫氫酶激酶活性，將糖酵解代謝途徑轉變?yōu)槠咸烟茄趸緩? 用二氯乙酸鹽對MCF-7 細胞進行處理后，利用該探針能夠對H2O2水平的上升和pH 的降低進行實時可視化成像.上述實驗結果表明，該納米探針能夠實現(xiàn)活細胞線粒體H2O2和pH變化的實時原位檢測（圖1）.

Fig.1 Schematic of the nanoprobe for imaging of mitochondrial pH and H2O2[43]

細胞自噬和凋亡是細胞自我毀滅的2種過程. 自噬是細胞處于饑餓狀態(tài)下溶酶體降解相關物質的過程，用于提供三磷酸腺苷，維持細胞的營養(yǎng)與能量. 凋亡是一種編碼細胞死亡形式，用于維持細胞穩(wěn)態(tài)［45］. 這些生物學過程中往往伴隨著活性小分子的變化，研究其動態(tài)變化對于闡釋疾病的活性分子調節(jié)機制十分重要［46］. 為了檢測細胞自噬和凋亡這2種生物學過程中pH和的動態(tài)變化，Tang等［47］設計了一種雙比率熒光納米探針，該納米探針以摻雜有羅丹明B的MNPs作為參比內(nèi)核，在其外層繼續(xù)包覆一層二氧化硅，外層的二氧化硅層中摻雜有能夠分別檢測pH 和的Tpy-Cy 和DBZTC 分子. 為了防止熒光分子泄露，在二氧化硅的外層包覆殼聚糖，之后，通過共價鍵連接的方式修飾上三苯基膦，用于靶向細胞線粒體. 實驗結果顯示，該探針的相對熒光強度在0～1.7 μmol/L 范圍內(nèi)與濃度呈現(xiàn)線性變化，在pH 5.5～8.5范圍內(nèi)與pH呈現(xiàn)線性變化. 該研究通過饑餓狀態(tài)誘導HeLa細胞發(fā)生自噬過程，通過L-丁硫氨酸亞砜亞胺（BSO）誘導HeLa 細胞發(fā)生凋亡過程，利用該探針進行檢測. 結果顯示，在自噬過程早期pH會下降，的水平幾乎不變；而在晚期pH會持續(xù)下降，的水平會升高. 對于凋亡過程而言，凋亡過程早期pH會降低，的水平升高，晚期pH幾乎保持不變，而的水平會持續(xù)升高（圖2）.

Fig.2 Schematic of the nanosensor formation and the structures of RhB,DBZTC and Tpy?Cy[47]

1.1.2 基于DNA四面體的熒光納米探針 線粒體對于維持鈣離子穩(wěn)態(tài)也具有重要作用，此功能的發(fā)揮同樣也需要維持相應的pH值［48］. 在腦缺血疾病模型中，鈣離子穩(wěn)態(tài)被打破，其水平的變化與pH的變化相關［49］. 因此，對這2 種活性小分子進行實時原位成像有助于理解其在生理病理過程中的作用.DNA四面體的形狀和尺寸可以精準控制，生物相容性好，有多個位點可進行分子修飾，可用于多種活性分子的檢測，并且被修飾分子的間隔距離可控，能夠有效避免多種響應分子同時修飾到納米顆粒上時熒光共振能力轉移（FRET）產(chǎn)生的影響［50］. 為了解決神經(jīng)元細胞線粒體中鈣離子和pH變化的實時原位檢測問題，Tian 等［51］在DNA 四面體納米探針的4 個端點分別修飾三苯基膦、異硫氰酸熒光素（FITC）、AF660 以及鈣離子探針（CD＠CaL）. 三苯基膦用于將該納米探針靶向到線粒體；FITC 分子親水、穩(wěn)定且無毒，不受細胞器內(nèi)酶的干擾，可以用于pH的檢測［52］；AF660作為參比熒光分子；鈣離子熒光探針由合成的鈣離子配體（CaL）和量子點（CDs）組成，可用于鈣離子的檢測（圖3）. 實驗結果表明，該探針對鈣離子的檢出限為0.3 μmol/L，熒光強度比在1～390 μmol/L范圍內(nèi)與鈣離子濃度呈線性關系，在pH 5.51～8.02范圍內(nèi)與pH呈現(xiàn)線性關系，證明該探針能夠實現(xiàn)神經(jīng)元細胞線粒體pH以及鈣離子的檢測. 作者利用該四面體比率熒光納米探針研究了在誘導下神經(jīng)元細胞死亡的信號通路.結果表明，的刺激能夠誘導神經(jīng)元細胞細胞質暫時性的酸化，進而激活線粒體膜ASIC1a通道，導致線粒體堿化以及鈣離子過載. Aβ的聚集會導致細胞質pH的降低以及鈣離子的爆發(fā)式增多，進一步通過ASIC1a導致線粒體酸化以及鈣離子過載.

Fig.3 Schematic illustration of the working principle of the developed DNA nanoprobe for Ca2+and pH sensing[51]

1.1.3 基于聚合物的熒光納米探針 聚合物納米探針具有單顆粒亮度強、光穩(wěn)定性好及毒性低的優(yōu)點［53，54］. 基于聚合物納米探針的優(yōu)勢，Gao等［32］首次利用半導體聚合物點作為載體，發(fā)展了一種比率熒光納米傳感器，對活細胞線粒體的pH進行了檢測和成像. 在該策略中，三苯基膦被修飾到聚乙烯醇壬基苯基酯上形成TTO-CO-520，然后TTO-CO-520、聚（9，9-二-N-辛基芴基-2，7-二基）（PFO）、聚（9，9-二辛基芴）-（4，7-二-2-噻吩基-2，1，3-苯并噻二唑）（PF-DBT5）和聚（苯乙烯-順丁烯二酸酐）（PSMA）通過共沉淀的方法形成熒光聚合物點. 該聚合物點含有羧基與線粒體靶向基團，可用于進一步修飾能夠響應pH的非熒光指示劑（剛果紅，CR）. 在該比率熒光納米探針中，PFO與PF-DBT5作為熒光能量供體，CR作為能量受體，當pH 發(fā)生變化時，CR 與PFO，CR 與PF-DBT5 的FRET 效率會發(fā)生改變. 利用380 nm的光對該探針進行激發(fā)，能夠獲得2 個發(fā)射波長（PFO：442 nm，PF-DBT5：616 nm），隨著pH 的降低（8.96～2.57），PFO的熒光強度不會發(fā)生明顯變化，PF-DBT5的熒光強度會降低，從而實現(xiàn)比率熒光檢測. 實驗結果表明，該探針的相對熒光強度比在pH 2.57～8.96范圍內(nèi)與pH呈線性相關；在pH 2.5～9范圍內(nèi)可實現(xiàn)可逆變化. 該探針能夠靶向Raw 264.7細胞線粒體，并對線粒體pH進行定量檢測（圖4）.

Fig.4 Schematic illustration of the mitochondria?targeted Pdots for ratiometric detection of pH in mitochondria[32]

為了解決熒光納米探針的毒性問題，Wang等［5］發(fā)展了一種以低毒性的β環(huán)糊精聚合物為骨架的比率熒光納米探針，用于成像活細胞線粒體pH變化. 2種親酯性的染料——金剛烷標記的熒光素和金剛烷標記的羅丹明分別用作pH檢測單元和參比單元，金剛烷標記的三苯基膦用作線粒體靶向基團. 基于主客體作用，β環(huán)糊精聚合物能夠與親酯性染料以及金剛烷標記的三苯基膦通過自組裝形成比率熒光納米顆粒. 該探針的相對熒光強度比在pH 4.0～9.0 之間能夠呈現(xiàn)可逆變化. 利用該探針能夠靶向HeLa細胞線粒體，對線粒體內(nèi)pH的變化進行定量檢測.

1.1.4 基于量子點的熒光納米探針 利用光動力學療法（PDT）治療癌癥，主要依賴于光敏劑產(chǎn)生活性氧對癌細胞進行殺傷［55］. 其中，過量的活性氧會導致線粒體過氧化，進而導致線粒體功能紊亂、凋亡，是治療癌癥的一種主要機制. 而細胞凋亡與線粒體pH 的變化密切相關，實時檢測pH 的變化能夠對PDT的治療效果進行更好的評估［56］. 碳量子點作為一種熒光納米材料，具有良好的光穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性及生物相容性，并且易于進行修飾［57，58］. 基于自然生物質制備的碳量子點被稱為生物質量子點（BQDs）. 這種生物質量子點成本低、易于大規(guī)模制備且環(huán)境友好［59］，可以用于生物傳感和成像. 為了實時監(jiān)測PDT過程中pH的變化，Liu等［60］設計了一種基于BQDs 的診療一體化比率熒光納米探針. 該探針既可以用于靶向癌細胞線粒體進行PDT，又能夠對PDT過程中線粒體pH的變化進行監(jiān)測. 其中，BQDs以碳量子點為基礎，利用含葉酸的桂花葉制備，以單波長進行激發(fā)可獲得雙波長發(fā)射. 在BQDs上修飾聚氧乙烯二胺及葉酸分子，形成比率熒光納米探針BQD-FAs. 葉酸分子能夠使探針靶向癌細胞，探針表面的正電荷能夠促進探針靶向線粒體. 由于探針表面富含葉綠素，所以在近紅外光的照射下能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧，用于對癌細胞進行殺傷. 此外，在pH 3～8 范圍內(nèi)，該探針的熒光強度比（F490/F650）與pH值呈線性關系，可用于線粒體pH變化的檢測（圖5）.

1.2 溶酶體pH檢測

溶酶體是一種細胞內(nèi)的酸性細胞器，內(nèi)含水解酶，能夠降解大分子和相關的細胞組分［61］. 溶酶體參與質膜修復、蛋白降解、病原體清除以及細胞內(nèi)吞與自噬等過程，對于維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用［62］. 這些功能的發(fā)揮都依賴于溶酶體pH穩(wěn)態(tài). 溶酶體pH的異常會導致溶酶體功能缺陷，進而導致相關疾病的發(fā)生［63］. 因此，對溶酶體pH進行檢測十分重要.

Fig.5 Schematic illustration of the preparation and application of BQD?FAs[60]

1.2.1 基于硅納米顆粒的熒光納米探針 pH響應的熒光納米探針可以通過2種方式聚集到細胞的溶酶體部位. 一種方式是在納米顆粒表面修飾溶酶體靶向基團，使納米顆粒能夠主動靶向到溶酶體的位置；另一種方式是通過細胞內(nèi)吞作用，使納米顆粒能夠最終自動聚集到溶酶體的位置. Tang等［39］報道了一種能夠靶向溶酶體進行pH檢測的比率熒光納米探針. 該探針由MNPs修飾參比分子EB、pH響應分子AF以及溶酶體靶向基團3-（4-嗎啉?；}酸丙酸（MPP）而成，可定位于MCF-7細胞溶酶體，結合其它納米顆粒，利用單一激發(fā)波長（488 nm）進行激發(fā)，能對溶酶體、線粒體以及細胞質pH的變化進行檢測（圖6）. 在另一種策略中，Han等［64］利用MNPs作為載體，修飾對pH不敏感的分子羅丹明內(nèi)酰胺以及pH敏感分子FITC，制得pH響應探針. 該探針的pH響應范圍為3.5～6，并且能夠通過內(nèi)吞的方式聚集到L929 細胞溶酶體，對pH 進行檢測. Bossi等［65］發(fā)展了一種具有良好生物相容性的pH 檢測熒光納米探針，螺羅丹明酰胺作為pH 響應分子被修飾到具有核殼結構的硅納米顆粒上，使納米探針能夠快速、可逆、高靈敏且高選擇性地進行pH檢測. 實驗結果表明，該熒光納米探針能夠定位于溶酶體，實現(xiàn)對pH的檢測.

為了解決對溶酶體內(nèi)pH 的實時、長時間成像問題，He等［66］發(fā)展了一種基于熒光硅納米顆粒的pH 納米探針. 在該探針中，熒光硅納米顆粒上偶聯(lián)有pH敏感的多巴胺分子以及pH不敏感的異硫氰酸羅丹明B 染料（RBITC）分子. 該納米傳感器與溶酶體染料的皮爾森相關系數(shù)高（0.9），能夠在較寬的pH范圍內(nèi)（4～10）對pH的波動進行檢測，具有良好的光穩(wěn)定性，在長時間的紫外光照射下，不會發(fā)生明顯的光強度減弱，適用于對溶酶體內(nèi)長時間pH波動的檢測（圖7）. 為了解決熒光探針光穩(wěn)定性的問題，He等［67］利用免標記的熒光硅量子點作為載體，在其上共價連接AS1411適配體. AS1411是一種富含鳥嘌呤的DNA適配體，能夠與癌細胞上過表達的核仁蛋白特異性結合. AS1411的末端修飾有pH敏感單元FAM，熒光硅納米顆粒能夠作為熒光參比單元. 該探針水溶性和光穩(wěn)定性良好，熒光響應強度高，能夠特異性地靶向MCF-7癌細胞并定位于溶酶體，結合流式細胞術，可對溶酶體的pH進行成像和定量分析.

溶酶體pH是反映溶酶體活性的一個重要參數(shù)，其變化也會受到其它因素的影響. 有研究［20］顯示，局部的溫度升高會上調溶酶體pH，所以測定pH時對溫度的影響進行補償非常重要. 細胞內(nèi)的熱量分布是不均一的，不同位置的溫度相差約1 ℃，所以同時對pH和溫度進行精準成像非常重要. Wang等［63］基于硅納米顆粒發(fā)展了一種同時對pH和溫度進行測定的納米探針. 在該探針中，參比銪復合物和對溫度敏感的探針羅丹明B被共價固定到硅納米顆粒的內(nèi)部，表面進行氨基修飾，氨基的修飾致使硅納米顆粒表面帶正電，能夠促進探針被細胞攝取，并使探針最終聚集于溶酶體. 此外，氨基可進一步用于pH敏感探針熒光素的修飾. 實驗結果表明，該納米探針可在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)對pH進行響應，在20～60 ℃范圍內(nèi)對溫度進行響應. 該納米探針能夠被HeLa細胞攝取并主要定位于溶酶體，適用于監(jiān)測溶酶體內(nèi)溫度和pH的動態(tài)變化.

Fig.6 Illustration of the ratiometric fluorescence nano?sensors for imaging of subcellular pH[39]

Fig.7 Design of dual?modified SiNPs(DMSiNPs)?based pH nanoprobe[66]

1.2.2 基于金納米顆粒的熒光納米探針 為了解決溶酶體pH 精準測定的問題，Russell 等［9］發(fā)展了一種基于金納米顆粒的比率熒光納米探針. 在該探針中，蒽衍生物配體基于光誘導電子轉移（PET）原理能夠對pH 進行響應，羅丹明衍生物配體則作為熒光參比分子. 為了防止金納米顆粒對2種分子熒光的猝滅，分別對這2種分子進行烷基鏈的修飾，使熒光分子與金納米顆粒之間能夠保持一定的距離. 最后，修飾有烷基鏈的2種分子通過金硫鍵連接到金納米顆粒的表面，形成最終的比率熒光pH 納米探針. 通過用364 nm 波長光激發(fā)，能夠獲得2種熒光分子的熒光發(fā)射峰. 該納米探針的熒光強度比（I421/I580） 在pH 3.73～8.11 范圍內(nèi)隨pH而變化. 該納米探針能夠被中國倉鼠卵巢（CHO）細胞攝取并最終聚集在溶酶體內(nèi)，可以用于溶酶體pH的定量測定（圖8）.

1.2.3 基于聚合物的熒光納米探針 為了解決聚合物納米探針因聚集而導致的熒光猝滅問題，Smet 等［68］發(fā)展了一種基于超支化聚合物的聚集誘導發(fā)光的熒光納米探針. 基于1，8-萘二甲酰亞胺染料分子具有的聚集誘導發(fā)光性質，將2種基于1，8-萘二甲酰亞胺的染料分子修飾到超支化聚合物納米顆粒上，其中一種能夠對pH進行響應，另外一種作為參比單元，制成比率熒光納米探針對pH進行檢測. 在水相中，該納米探針能夠發(fā)出熒光，并且能夠在pH 4.5～8.4范圍內(nèi)響應pH的變化. 共定位實驗結果表明，該探針可定位于HeLa細胞溶酶體，對溶酶體的pH進行測定. 為了拓寬納米探針對pH的檢測范圍，實現(xiàn)活細胞內(nèi)低pH條件下的比率測定，S?ndergaard等［69］將3種pH敏感的熒光團二氟俄勒岡州綠、俄勒岡州綠、熒光素以及pH不敏感熒光團Alexa 568共價修飾到水凝膠中，構建了比率pH 熒光納米探針. 多熒光團的使用拓寬了熒光納米探針的pH 檢測范圍，使熒光探針能夠在pH 1.4～7.0范圍內(nèi)響應pH的變化，從而用于溶酶體內(nèi)pH的檢測. Almdal等［70］發(fā)展了一種基于聚丙烯酰胺聚合物的比率熒光納米探針，以羅丹明作為參比單元，俄勒岡綠作為pH敏感單元，利用反相微乳液技術形成聚合物納米探針. 該探針能夠在pH 4.1～5.7范圍內(nèi)對pH進行響應，并且可以通過內(nèi)吞途徑到達溶酶體，對溶酶體的pH進行檢測. 為了更好地實現(xiàn)溶酶體內(nèi)pH的比率熒光成像，Jiang等［71］通過微乳液聚合及表面修飾法構建了一種基于FRET 的比率熒光聚合物納米探針（RFPNS）. 在該探針中，4-乙氧基-9-烯丙基-1，8-萘二甲酰亞胺（EANI）作為供體，F(xiàn)ITC 作為受體，同時也作為pH 響應單元. 當pH升高時，F(xiàn)ITC能轉變?yōu)橐环N環(huán)打開的狀態(tài)，此時，EANI能夠與開環(huán)狀態(tài)的FITC發(fā)生FRET，從而實現(xiàn)對pH的比率熒光識別. 該納米探針水溶性良好，能夠定位在HeLa細胞的溶酶體內(nèi)，可視化成像溶酶體pH的變化.

1.2.4 基于量子點的熒光納米探針 量子點作為一種熒光納米材料，其水溶性與光穩(wěn)定性良好，本身可以用作熒光納米探針的載體，并且由于其自身的熒光可以作為熒光納米探針的參比，不需要利用其它的熒光分子作為參比單元. 基于量子點特有的優(yōu)勢，Wu等［72］將pH敏感單元FITC直接連接到碳量子點上，碳量子點與FITC分子構成FRET系統(tǒng)，從而構建了比率熒光納米探針. 當pH降低時，413 nm處碳量子點的熒光發(fā)射強度會下降，531 nm 處FITC 的熒光發(fā)射強度會升高. 二者熒光強度的比值（I531/I413）隨著pH的變化而變化. 該探針能夠通過內(nèi)吞的方式進入細胞并且聚集在溶酶體，可以對溶酶體pH進行檢測.

為了解決量子點探針靶向溶酶體的問題，Wang等［73］合成了一種氨基功能化的碳量子點（ACDs）用于溶酶體pH的檢測. 該量子點由檸檬酸和尿素制備而成，納米顆粒表面羧基的含量高于氨基的含量，能夠響應4.0～5.4范圍內(nèi)pH的變化. 該探針無需靶向基團的修飾，能夠通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞進入細胞并最終定位于溶酶體，與溶酶體染料的皮爾森相關系數(shù)為0.95. 利用該量子點熒光納米探針，能夠實現(xiàn)MCF-7細胞內(nèi)溶酶體pH成像，在氯喹的刺激下可檢測出溶酶體pH的升高. Xie 等［74］制備了一種能夠靶向溶酶體的碳量子點熒光納米探針，適用于在活細胞和活體水平上進行pH的檢測. 該量子點由對苯二胺和硫脲制備，受到pH的影響時，量子點表面的電荷會發(fā)生變化，從而引起熒光強度的變化. 隨著pH的升高，熒光強度會逐漸減弱，能夠在pH 4～8的范圍內(nèi)響應pH的變化. 該探針可通過內(nèi)吞作用進入HeLa 細胞的溶酶體內(nèi)對pH的變化進行成像. 此外，作者以LPS誘導炎癥模型，利用該探針在活體水平上對炎癥過程中pH降低的變化進行了檢測.

1.2.5 基于上轉化納米顆粒（UCNPs）的熒光納米探針 UCNPs 是一類摻雜鑭系離子的獨特的納米材料，能夠將2 個或者更多低能量的光子轉變成為1 個高能量的光子［75］. UCNPs 可以通過近紅外光激發(fā)來獲取可見光以及紫外光發(fā)射. 近紅外光與可見光及紫外光相比，組織穿透深度更深，對于組織損傷小，可有效避免檢測過程中光漂白以及背景熒光干擾等問題，從而提高熒光檢測的準確性［76］. 基于上轉換納米顆粒特有的優(yōu)勢，Sch?ferling 等［77］發(fā)展了一種比率熒光納米探針，pH 敏感分子pHrodo?紅染料分子被共價修飾到包覆有硅殼層的上轉化納米顆粒表面用于檢測pH的變化. 該納米探針以980 nm的近紅外光作為激發(fā)光，激發(fā)UCNPs發(fā)射550 nm波長的熒光，該熒光可以進一步用于pHrodo?紅染料分子的激發(fā)，構成上轉化共振能量轉移（UC-RET），形成pHrodo?紅染料分子590 nm處的熒光發(fā)射峰.由于受體染料分子少，所以UCNPs發(fā)出熒光的強度基本不會變化，因此上轉化納米顆粒本身可以作為參比單元. 該探針的熒光強度比在pH 3～6.7范圍內(nèi)與pH變化呈線性關系，能夠用于測定溶酶體pH.基于類似原理，Kong等［78］將pH敏感分子FITC修飾到上轉化納米顆粒表面，構建了比率熒光探針用于溶酶體pH的檢測. 不同的是，該UCNPs在980 nm的近紅外光激發(fā)下，可獲得475和645 nm 2個發(fā)射波長的發(fā)射峰，其中475 nm 的發(fā)射光可用于激發(fā)FITC 分子，645 nm 的光可作為參比熒光.I475/645在pH 3～7范圍內(nèi)與pH值呈線性相關. Li等［79］報道了一種基于雙光子激發(fā)的比率熒光納米探針. 該探針包含對pH不敏感的UCNP核，其在810 nm具有發(fā)射峰，可作為熒光參比單元. UCNP核上包覆介孔二氧化硅殼，在殼層的孔道中裝載pH敏感的雙光子染料分子反式-4-［對-（N，N-二乙氨基）苯乙烯基］-碘化甲基吡啶鎓（DMI），然后在二氧化硅殼層上進一步修飾β-環(huán)糊精，用于提高納米探針的親水性和生物相容性. 利用920 nm波長光進行激發(fā)，可獲得610 nm處DMI的熒光發(fā)射峰及810 nm處上轉化納米顆粒的發(fā)射峰. 當pH升高時，DMI的熒光強度會顯著上升，而上轉換納米顆粒的熒光幾乎不變. 熒光強度比例I610/I810在pH 4.0～6.5范圍內(nèi)隨著pH的升高而增大. 該納米顆粒能夠選擇性地聚集在溶酶體內(nèi)，對藥物刺激下溶酶體pH的變化進行測定（圖9）.

Fig.9 Schematic of sensing mechanism of the TPE ratiometric fluorescent nanoprobe for intracellular pH measurement[79]

1.3 內(nèi)質網(wǎng)pH檢測

內(nèi)質網(wǎng)是細胞中一類重要的細胞器，在鈣離子穩(wěn)態(tài)、脂質合成及折疊、膜的成熟和蛋白的分泌方面具有重要作用. 當內(nèi)質網(wǎng)的功能受到外界條件干擾時，會產(chǎn)生內(nèi)質網(wǎng)壓力，內(nèi)質網(wǎng)壓力會誘導自噬過程的發(fā)生，導致內(nèi)質網(wǎng)的酸化，這種酸化的過程與內(nèi)質網(wǎng)誘導的疾病的發(fā)生有密切關系［80～82］. 因此，實時成像內(nèi)質網(wǎng)的pH變化對于探究相關疾病的病理十分重要.

為了實現(xiàn)內(nèi)質網(wǎng)pH 的檢測，Wang 等［73］利用檸檬酸和尿素合成了一種表面帶有氨基的碳量子點（ACDs），然后進一步修飾月桂胺，獲得月桂胺修飾的碳量子點（LCDs）. 該LCDs 能夠響應6.2～7.2 范圍內(nèi)pH的變化，通過脂筏內(nèi)吞作用和網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入MCF-7細胞，聚集于內(nèi)質網(wǎng)，與內(nèi)質網(wǎng)定位染料的皮爾森相關系數(shù)可達0.92. 在抗炎藥物地塞米松的刺激下，該探針可實現(xiàn)對內(nèi)質網(wǎng)pH降低的檢測.

2 總結與展望

本文綜述了近年來利用不同類型的熒光納米探針對細胞器內(nèi)pH 進行實時成像與檢測的研究進展. 這些熒光納米顆粒具有自身特有的優(yōu)勢：介孔二氧化硅納米顆粒易于合成、修飾且成本低；聚合物納米顆粒水溶性良好且毒性低；量子點具有自發(fā)光性質與良好的光穩(wěn)定性；上轉化納米顆?？梢岳媒t外光進行激發(fā)，減少檢測背景干擾. 總體而言，熒光納米顆粒易于合成、光穩(wěn)定性好、特異性強且受環(huán)境的干擾小，通過在熒光納米顆粒上修飾多種響應分子，可用于實時、原位研究pH與其它活性分子之間變化的關系. 這對于研究由細胞器pH變化引起的相關疾病的致病機理具有重要意義. 但是，對于細胞器內(nèi)pH 的檢測還面臨如下問題與挑戰(zhàn)：（1）納米顆粒易于合成、修飾，但經(jīng)過多步修飾后，納米顆粒往往容易發(fā)生聚集，其批次間合成的質量控制問題需要進一步解決.（2）熒光納米探針在細胞內(nèi)的不穩(wěn)定性可能導致其在細胞內(nèi)的分布不均，從而對pH的測定產(chǎn)生影響.（3）熒光染料分子修飾到納米顆粒上，染料分子聚集所產(chǎn)生的猝滅效應會影響pH檢測的準確性，進一步消除基于不同納米材料熒光納米探針的熒光猝滅效應，對于提高pH檢測的準確性具有重要意義.（4）特定細胞器內(nèi)pH的變化通常會與其它多種活性分子的變化相關聯(lián)，需要進一步發(fā)展能夠同時對pH和其它多種活性分子進行成像的熒光納米探針，用于研究疾病發(fā)生過程中各種活性分子的實時變化.（5）活細胞細胞器pH的波動范圍較小，需要進一步發(fā)展高靈敏的pH熒光納米探針，對于細胞器內(nèi)微小pH的變化進行精準檢測.（6）目前的細胞器pH熒光納米探針主要利用細胞器靶向基團實現(xiàn)細胞器的靶向，檢測的細胞器多集中于線粒體和溶酶體，缺少對于內(nèi)質網(wǎng)、高爾基體及細胞核等細胞器pH檢測的熒光納米探針，進一步發(fā)展靶向這些細胞器的熒光納米探針進行pH檢測，可為研究細胞器內(nèi)的pH與相關疾病的關系提供合適的工具.