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    恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝及代謝關(guān)鍵酶

    2020-09-21 09:06:10劉婉玉TadiyoseGirmaBekele趙洪霞
    生態(tài)毒理學報 2020年3期
    關(guān)鍵詞:微粒體恩諾香豆素

    劉婉玉,Tadiyose Girma Bekele,趙洪霞

    大連理工大學環(huán)境學院,工業(yè)生態(tài)和環(huán)境工程教育部重點實驗室,大連 116024

    恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)是第三代人工合成的氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物,具有抗菌譜廣、殺菌性強的特點而被大量應用于人類和獸類疾病的預防與治療[1]。在實際生產(chǎn)中,不遵守休藥期的藥物濫用情況十分嚴重[2-3]。這不僅會給動物機體造成傷害,更會隨著食物鏈的傳遞危害人類健康。恩諾沙星進入生物體內(nèi)后,會在生物體藥物代謝酶的作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,可能會產(chǎn)生毒性更強的代謝產(chǎn)物,從而影響其生態(tài)毒性。細胞色素P450酶(CYP450)又被稱為多功能氧化酶,是一類廣泛分布于生物體內(nèi)的藥物代謝酶,能夠參與外源性物質(zhì)如抗生素、農(nóng)藥和麻醉劑等的生物轉(zhuǎn)化,在污染物的生物轉(zhuǎn)化過程中起著十分關(guān)鍵的作用[4]。目前,關(guān)于恩諾沙星的生物代謝研究大多是關(guān)于其在生物體內(nèi)的消除規(guī)律及其在不同組織中的代謝產(chǎn)物識別[5-8],對于其在水生生物體CYP450作用下的代謝轉(zhuǎn)化機制尚不清楚,恩諾沙星代謝的關(guān)鍵酶還未確定,因此,有必要對其在水生生物體CYP450酶作用下的代謝轉(zhuǎn)化進行深入研究。本研究采用鯽魚肝微粒體體外孵育法,探究恩諾沙星在CYP450酶的作用下的代謝轉(zhuǎn)化過程及參與其代謝的關(guān)鍵酶,以期為評價其生態(tài)和健康風險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 實驗動物

    實驗動物為鯽魚,購于大連市中山公園花鳥魚蟲市場,個體質(zhì)量為240~300 g。實驗前將其暫養(yǎng)10 d,養(yǎng)殖水為自來水,使用前連續(xù)曝氣24 h,水溫為(28 ± 1) ℃。

    1.2 主要試劑

    恩諾沙星及環(huán)丙沙星標準品(大連美侖生物技術(shù)有限公司);乙腈、甲醇、二氯甲烷、酮康唑、雙硫侖和二甲基亞砜(色譜純,美國Sigma公司);還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、三羥甲基氨基甲烷和甘氨酸(分析純,北京索萊寶科技有限公司);磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀和氯化鈣(分析純,天津市大茂化學試劑廠);乙二胺四乙酸二鈉(分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司)。

    1.3 主要儀器設(shè)備

    高效液相色譜儀(美國Agilent公司,Agilent 1100);高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司,Xevo TQ-S);熒光分光光度計(日本Hitachi公司,F(xiàn)4500);冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司,H1750R);紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司,UV 6100);手持式勻漿機(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司,F(xiàn)6/10);全溫振蕩培養(yǎng)箱(天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司,ZQPW-70)。

    1.4 緩沖溶液配制

    0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS):稱取11.18 g KCl、80 g NaCl、32.3 g Na2HPO4·12H2O、4.5 g NaH2PO4·2H2O和0.029 g 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA),用超純水溶解,濃HCl調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至1 L。

    勻漿緩沖液為含10%(V∶V)甘油的0.1 mol·L-1PBS緩沖溶液。保存緩沖液為含20%(V∶V)甘油的0.1 mol·L-1PBS緩沖溶液。0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液:稱取12.11 g三羥甲基氨基甲烷(Tris),用超純水溶解,濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至1 L。

    1.5 肝微粒體制備

    鯽魚肝微粒體制備參照沈夢楠[9]的方法。取健康的鯽魚,置于冰上解剖得到鯽魚的肝臟組織,用5 mL預冷的緩沖溶液反復沖洗3次,洗去血紅蛋白,用濾紙擦去多余的液體,稱重。組織剪碎后按1∶4 (m∶V)加入預冷的勻漿緩沖液,用內(nèi)切式組織勻漿機于冰浴中制成勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)入預冷離心管中,4 ℃、10 000 g離心30 min,小心取出全部上清液,按10∶1(V∶V)加入88 mmol·L-1的CaCl2溶液,混勻后,于4 ℃、15 000 g離心60 min。棄上清,沉淀即為微粒體組分。將微粒體沉淀取出后加入少許保存緩沖液,保持冰浴環(huán)境渦旋振蕩1 min,進行2次,充分混勻,分裝于凍存管中,置-80 ℃保存,以備檢測用。

    1.6 體外孵育實驗

    恩諾沙星暴露濃度、微粒體蛋白含量和反應溫度的設(shè)置參照文獻[10]。樣品組設(shè)置3個濃度組,恩諾沙星終濃度分別為1、5和10 mg·L-1。樣品體系主要包含0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4),1 mmol·L-1NADPH、10 mg微粒體蛋白和恩諾沙星(1、5或10 mg·L-1),反應體系總體積為1 mL。除樣品組外還設(shè)置空白對照組,即不含目標化合物組,在體外孵育體系中加入100 μL超純水代替恩諾沙星。反應體系于28 ℃預孵5 min后,加入NADPH以啟動反應,反應溫度為28 ℃,分別孵育0、5、15、45和90 min,加入2 mL預冷的二氯甲烷終止反應。所有樣品均設(shè)置3組平行。

    1.7 代謝抑制實驗

    代謝抑制實驗中,選擇雙硫侖和酮康唑作為抑制劑。樣品組抑制劑設(shè)置2個濃度組,分別為5 μmol·L-1和50 μmol·L-1。樣品體系主要包含0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)、1 mmol·L-1NADPH、10 mg微粒體蛋白、恩諾沙星(1、5或10 mg·L-1)和抑制劑(5 μmol·L-1或50 μmol·L-1),反應體系總體積為1 mL。對照組不含抑制劑,在體外孵育體系中加入25 μL 二甲基亞砜(DMSO)代替抑制劑。代謝抑制實驗中,首先在反應體系中加入25 μL抑制劑和NADPH,28 ℃預孵5 min后加入恩諾沙星,反應體系28 ℃孵育90 min后,加入2 mL預冷的二氯甲烷終止反應。所有樣品均設(shè)置3組平行。

    1.8 樣品前處理

    將終止反應的體外孵育樣品置于渦旋混合器振蕩混合1 min,于4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min,取二氯甲烷有機相,移入氮吹管中,剩余殘渣加入1 mL的二氯甲烷,再次渦旋混合后離心。重復2次后,合并有機相,在40 ℃氮氣流下吹干,以1 mL超純水定容,過0. 22 μm濾膜后,檢測分析。

    1.9 酶活性測定方法

    1.9.1 苯胺4-羥化酶(AH)活性測定

    AH活性測定參照Burkina等[11]的方法。4-氨基酚標準曲線制備:分別取10 μmol·L-14-氨基酚0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8和1. 0 mL,用質(zhì)量分數(shù)為6%的三氯醋酸(TCA)補足至1.0 mL,加入體積分數(shù)為1%的苯酚1 mL,混勻后再加入1 mol·L-1的Na2CO3溶液1 mL,充分混勻后,放置30 min,空白調(diào)零,于630 nm處測定各管的吸光度值,繪制4-氨基酚標準曲線。AH活性測定:取10 mmol·L-1NADPH溶液0.1 mL和10 mmol·L-1鹽酸苯胺溶液0.5 mL,置于試管中,混勻,對照管加0.5 mL超純水代替苯胺,28 ℃孵育2 min。各管均加0.5 mL微粒體懸液,28 ℃再孵育30 min,加1 mL冰冷的質(zhì)量分數(shù)為20%的TCA終止反應。冰浴5 min,11 000 r·min-1離心,取上清液1 mL于另一試管中,加體積分數(shù)為1%的苯酚1 mL,混勻,再加入1 mol·L-1的Na2CO31.0 mL,充分混勻后,放置30 min,空白調(diào)零,于630 nm處測定各管的吸光度值,根據(jù)標準曲線計算4-氨基酚濃度,以nmol(4-氨基酚)·min-1·mg-1表示其酶活性。

    1.9.2 7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)活性測定

    ECOD活性測定參照李陽等[12]的方法。7-羥基香豆素標準曲線制備:分別取1.62 mg·L-1的7-羥基香豆素溶液0、0.25、0.5、1、1.5和2.0 mL,用Tris-HCl溶液補足到5.0 mL,混勻后于390 nm激發(fā)波長和440 nm發(fā)射波長下測定上述各濃度7-羥基香豆素對應的熒光強度,繪制7-羥基香豆素標準曲線。ECOD活性測定:取0.5 mL微粒體蛋白懸液,加入20 μL的底物7-乙氧基香豆素(終濃度為1.0 mmol·L-1),混勻后以0.1 mol·L-1、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液補充到1 mL,28 ℃孵育2 min后,測定管加入10 mmol·L-1NADPH 0.1 mL,空白管加入超純水0.1 mL。28 ℃孵育20 min后迅速取出并置于冰上,加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的TCA終止反應。反應完畢后,將反應混合液于4 ℃、10 000 r·min-1下離心5 min,取上清,加入2 mL 甘氨酸-氫氧化鈉(Gly-NaOH)溶液(0.6 mol·L-1,pH 10.5),震蕩混勻后,在激發(fā)波長為335 nm、發(fā)射波長為455 nm下測定產(chǎn)物的熒光值,根據(jù)標準曲線計算7-羥基香豆素濃度,以nmol(7-羥基香豆素) ·min-1·mg-1表示其酶活性。

    1.10 檢測條件

    1.10.1 HPLC檢測條件

    色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×150 mm,3.5 μm),流動相為體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液和乙腈(V∶V=7∶3),流速為0.4 mL·min-1,進樣量為20 μL,柱溫為30 ℃,檢測波長為283 nm。

    1.10.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測條件

    色譜柱為Waters Symmetry C8 (50 mm×2.l mm,5 μm),柱溫為25 ℃,流速為0.3 mL·min-1,進樣量為10 μL,流動相A為0.005 mol·L-1醋酸銨溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH至2.5),B為乙腈,梯度洗脫條件:0~5 min,3%~25% B;5~6 min,25%~35% B;6~7 min,35%~55% B;7~8 min,55% B;8~9.5 min,55%~3% B;9.5~12.5 min,3% B。

    質(zhì)譜條件:電離模式為ESI+,離子源溫度為150 ℃,多溶劑氣溫度為350 ℃,錐孔電壓為25 V,碰撞能為15 eV,掃描模式為SIR和子離子掃描。

    2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

    2.1 恩諾沙星體外代謝

    2.1.1 恩諾沙星體外代謝動力學

    恩諾沙星暴露濃度參照文獻中的濃度設(shè)置[10],當恩諾沙星體外暴露濃度為1、5和10 mg·L-1時,恩諾沙星體外代謝過程符合一級動力學方程lnCt/C0=-kt,動力學擬合曲線圖1所示。擬合得到恩諾沙星在鯽魚肝微粒中的代謝動力學參數(shù),包括消除速率常數(shù)(k)、半衰期(t1/2),如表1所示。當恩諾沙星體外暴露濃度為1、5和10 mg·L-1時,恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的k分別是0.00303、0.00204和0.00266 min-1,半衰期t1/2分別是228.8、339.8和260.6 min,其中當恩諾沙星暴露濃度為1 mg·L-1時,其在肝微粒體中的k最大,為0.00303 min-1,t1/2最短,為228.8 min。本研究中恩諾沙星在1、5和10 mg·L-13個暴露濃度條件下的t1/2均比Shan等[13]的研究中恩諾沙星在鯽魚體內(nèi)t1/2(64.66 h)的值低,這可能是體外代謝實驗中的恩諾沙星能夠與代謝酶直接接觸,避免了體內(nèi)復雜生理因素的干擾,使其代謝轉(zhuǎn)化速率變高,半衰期縮短。

    圖1 恩諾沙星代謝動力學擬合曲線Fig. 1 Fitting curve of enrofloxacin metabolic kinetics

    2.1.2 恩諾沙星體外代謝產(chǎn)物

    恩諾沙星暴露濃度為10 mg·L-1,孵育90 min,采用HPLC-MS/MS技術(shù),對恩諾沙星及其在鯽魚肝微粒體中的代謝產(chǎn)物進行識別。首先,通過對比空白組與實驗組的色譜圖,共篩選出2種可能存在的代謝產(chǎn)物(M1和M2),其保留時間等信息如表2所示。然后,根據(jù)其二級質(zhì)譜圖(圖2)的碎片信息,結(jié)合母體化合物的結(jié)構(gòu),初步推測出產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。

    圖2 恩諾沙星代謝產(chǎn)物二級質(zhì)譜圖Fig. 2 MS2 spectra of enrofloxacin metabolite

    通過與恩諾沙星標準品的保留時間及碎片離子的比對,可以確定M0為母體化合物恩諾沙星,其保留時間是3.26 min,分子式是[C19H23N3O3F]+,主要碎片離子是342 [MH-F]+、316 [MH-CO2]+和245 [MH-CO2-C2H4NC2H5]+。環(huán)丙沙星是恩諾沙星常見的代謝產(chǎn)物,根據(jù)與環(huán)丙沙星標準品的保留時間及碎片離子的比對,可以確定M1為環(huán)丙沙星,保留時間2.97 min,分子式[C17H19FN3O3]+,主要碎片離子是245 [MH-CO2-C2H4NH]+和231 [MH-CO2-C2H5N2]+。M2的保留時間是3.12 min,準分子離子是372 [C20H26N3O4]+,主要碎片離子是297 [MH-CO2-O-CH3]+、257 [MH-CO2-O-CH3-C3H4]+和241 [MH-CO2-O-C2H5N-C2H4]+,其分子量比母體化合物增加了12 Da,推測是恩諾沙星脫氟后羥基化,再進一步發(fā)生甲基化得到的產(chǎn)物。

    表1 恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝動力學參數(shù)Table 1 Metabolic kinetic parameters of enrofloxacin in liver microsomes of crucian carp (Carassius auratus)

    表2 恩諾沙星及其在鯽魚肝微粒體中代謝產(chǎn)物的保留時間、分子量和分子式Table 2 Retention time, molecular weight and molecular formula of enrofloxacin and its metabolites in liver microsomes of crucian carp (Carassius auratus)

    恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝是在CYP450酶的作用下發(fā)生的。細胞色素P450酶有很多亞型。其中,在CYP3A4亞型作用下,外源污染物能夠發(fā)生脫甲基、脫乙基反應[14],在CYP2E1亞型作用下外源污染物發(fā)生羥基化反應[15]。因此,推測M1是在CYP3A4作用下的產(chǎn)物,M2是CYP2E1作用下的產(chǎn)物,CYP3A4和CYP2E1是主要參與恩諾沙星體外代謝的P450亞型酶。

    2.2 恩諾沙星體外代謝關(guān)鍵酶的確定

    為了確定參與恩諾沙星代謝關(guān)鍵酶,首先分析了在體外孵育條件下,恩諾沙星對CYP3A4和CYP2E1亞型酶活性的影響。7-乙氧基香豆素是一種CYP3A4亞型的特異性底物,通過ECOD反映CYP3A4總酶活性,苯胺是CYP2E1亞型的特異性底物,以AH反映CYP2E1總酶活性[16-17]。在不同濃度恩諾沙星體外暴露的條件下,AH和ECOD酶活性隨時間變化趨勢如圖3所示。

    圖3 苯胺4-羥化酶和7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶活性隨時間的變化Fig. 3 The change of aniline 4-hydroxylase (AH) and 7-ethoxycoumarin-O-deethylase (ECOD) activities with time

    恩諾沙星對AH和ECOD的活性均有一定的抑制作用。AH活性隨時間呈線性下降趨勢。當恩諾沙星濃度增加時,對AH活性抑制作用增強;ECOD活性在0~5 min時,下降趨勢明顯,在5 min后ECOD活性下降趨勢逐漸變緩。為了進一步考察恩諾沙星濃度對AH和ECOD活性的影響,利用SPSS對恩諾沙星濃度和酶活性作相關(guān)性分析。結(jié)果表明,ECOD活性與恩諾沙星濃度顯著性負相關(guān),皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.617;AH活性與恩諾沙星濃度無顯著性相關(guān)關(guān)系(α=0.05)。恩諾沙星對ECOD和AH酶活性有抑制作用。這說明,恩諾沙星具有與CYP3A4和CYP2E1酶結(jié)合的能力,CYP3A4和CYP2E1參與了恩諾沙星的代謝。

    代謝抑制實驗中,加入特異性抑制劑與恩諾沙星共同孵育,根據(jù)實驗結(jié)果可初步判斷參與恩諾沙星代謝的CYP450酶亞型。選擇酮康唑(KTZ)和雙硫侖(DIS)分別作為CYP3A4和CYP2E1的抑制劑,抑制劑濃度為5 μmol·L-1和50 μmol·L-1,這2個濃度的選擇參考了文獻[18-19],這是能夠有效抑制相應CYP450亞型活性的濃度。加入不同濃度的KTZ和DIS后,恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝轉(zhuǎn)化率有不同程度的降低,其抑制情況如圖4所示。

    如圖4所示,當恩諾沙星暴露濃度為1、5和10 mg·L-1時,5 μmol·L-1的KTZ和DIS對恩諾沙星代謝均有較弱的抑制作用。KTZ和DIS的濃度增加至50 μmol·L-1時,KTZ對恩諾沙星代謝的抑制率明顯增加,抑制率最高可達80%,而DIS的濃度改變對恩諾沙星代謝抑制率影響較小。因此,與CYP2E1亞型相比,CYP3A4在恩諾沙星代謝過程中作用更大,CYP3A4亞型是恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中代謝的關(guān)鍵亞型酶。

    圖4 雙硫侖(DIS)和酮康唑(KTZ)對恩諾沙星體外代謝的影響Fig. 4 Effects of disulfiram (DIS) and ketoconazole (KTZ) on the in vitro metabolism of enrofloxacin

    綜上所述,恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝符合一級動力學方程,體外代謝過程中恩諾沙星對CYP3A4和CYP2E1亞型酶活性有一定的抑制作用,CYP3A4亞型酶活性與恩諾沙星呈顯著性負相關(guān)關(guān)系,CYP3A4是參與恩諾沙星代謝的關(guān)鍵亞型酶。本研究結(jié)果為探究恩諾沙星在水生生物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化路徑及其生態(tài)風險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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