• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    環(huán)境中可致肝臟損傷化學(xué)成分體外篩選模型的建立

    2020-09-21 09:46:28高美琪林鶴于娜劉兆泉任利翔
    生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2020年3期
    關(guān)鍵詞:化學(xué)物質(zhì)毒性陰性

    高美琪,林鶴,于娜,劉兆泉,任利翔,*

    1. 沈陽化工研究院有限公司安全評(píng)價(jià)中心,沈陽 110021 2. 沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,沈陽 110016

    環(huán)境中的各種化學(xué)物質(zhì)可通過不同途徑進(jìn)入人體。肝臟作為主要的代謝器官無疑最易受到損害。如何快速、準(zhǔn)確和多維度地進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)肝臟毒性篩選,對(duì)于化學(xué)品環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)防控具有重要意義。

    化學(xué)物質(zhì)可通過多種作用機(jī)制誘導(dǎo)肝損傷[1-2],主要包括:破壞鈣離子平衡和細(xì)胞膜損傷、膽汁淤積和膽小管損傷、激活經(jīng)肝藥酶代謝、激活自身免疫、激活細(xì)胞凋亡和線粒體損傷等[3]。事實(shí)上,這些機(jī)制不是完全孤立存在的,細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)對(duì)細(xì)胞的生存極為重要,鈣離子跨膜內(nèi)流會(huì)聚集在線粒體,引起線粒體膜電位降低,進(jìn)而產(chǎn)生大量氧自由基,最后導(dǎo)致線粒體和肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷[4-5]。

    高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下,同時(shí)檢測(cè)被篩化合物對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響,在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量與基因、蛋白及其他細(xì)胞成分相關(guān)的信息,確定其生物活性和潛在毒性的過程。高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)彌補(bǔ)了毒理學(xué)篩選系統(tǒng)在通量、毒性機(jī)制檢測(cè)和潛在毒性揭示等方面的不足,為化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)研究提供了新的有效的技術(shù)。近年來,高內(nèi)涵能夠?qū)崟r(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體外肝細(xì)胞毒性的多個(gè)參數(shù)、毒理學(xué)相關(guān)機(jī)制,是評(píng)估候選化學(xué)物質(zhì)肝細(xì)胞毒性和預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)肝臟毒性的有效手段[6-7]。根據(jù)肝損傷的發(fā)生機(jī)制,高內(nèi)涵檢測(cè)的熒光探針主要包括:Hoechst 33342、DCFH-DA、MitoTrackerDeep Red FM、mBBr和DIOC6(3)等,它們分別用來檢測(cè)細(xì)胞核的損傷、細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平、線粒體膜電位的情況、谷胱甘肽含量和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷程度等[8-9]。

    人源肝癌細(xì)胞系HepG2具有正常肝細(xì)胞的很多功能和特點(diǎn),保留了較完整的生物轉(zhuǎn)化酶體系,敏感性高,與原代肝細(xì)胞及HepRG細(xì)胞相比更為穩(wěn)定、成熟,被認(rèn)為是體外肝細(xì)胞篩選的理想模型之一。而L-02細(xì)胞是人正常肝細(xì)胞系,沒有癌變細(xì)胞的特征,功能表達(dá)完整,可以傳代培養(yǎng),已經(jīng)大量應(yīng)用在體外肝毒性篩選過程中[10]。因此,本研究通過以HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞為對(duì)象,建立2種肝損傷體外篩選模型,并比較2種細(xì)胞預(yù)測(cè)肝損傷的能力,選出更有優(yōu)勢(shì)的體外篩選模型。

    環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的肝損傷是不容忽視的問題,且其篩選模型仍然是目前研究的熱點(diǎn)。大多數(shù)篩選模型只以單一參數(shù)為判斷標(biāo)準(zhǔn),缺乏準(zhǔn)確性。而目前還沒有合適的體外篩選模型和篩選方法能夠有效地篩選出具有肝損傷風(fēng)險(xiǎn)的化學(xué)物質(zhì),所以建立適宜的肝損傷篩選模型尤為重要。本研究選取2種肝細(xì)胞、5種陽性藥及3種陰性藥,首先用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)考察不同藥物對(duì)2種細(xì)胞體外的生長抑制作用,并且采用高內(nèi)涵檢測(cè)法考察2種細(xì)胞預(yù)測(cè)肝損傷的能力,并采用實(shí)時(shí)定量PCR法比較了2種細(xì)胞的藥物代謝酶含量。理論上,可以通過比較2種細(xì)胞對(duì)陽性藥的敏感性、預(yù)測(cè)肝損傷機(jī)制的準(zhǔn)確性以及人體肝藥酶水平的含量選出最適宜的細(xì)胞模型。希望通過這些研究,可以為環(huán)境中能夠?qū)е赂味拘曰瘜W(xué)成分的發(fā)現(xiàn)和篩選以及其肝損傷機(jī)制的確定奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 細(xì)胞株

    本實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞系為HepG2人源肝癌細(xì)胞系和L-02人源正常肝細(xì)胞系,均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

    1.2 主要儀器與試劑

    鹽酸胺碘酮(99.9%)、鹽酸四環(huán)素(97.5%)、利福平(99.9%)和地塞米松(99.7%)購自中國食品藥品檢定研究院;雙氯芬酸鈉(99.0%)、他莫昔芬(99.0%)和DIOC6(3)(98.0%)熒光探針購自aladdin公司;檸檬酸三鈉(99.0%)購自西隴化工股份有限公司;抗壞血酸(99.0%)、二甲基亞砜(99.7%)、噻唑藍(lán)(98.0%)和mBBr(99.0%)熒光探針購自Sigma公司;Hoechst 33342、DCFH-DA熒光探針和SYBR Green qPCR Mix(2×)購自碧云天生物技術(shù)有限公司;MitoTrackerDeep Red FM熒光探針購自Yeasen公司。

    多功能酶標(biāo)儀(Synergy HT,美國Bio-Tek公司),高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(CELLINSIGHT CX7,美國Thermo公司),實(shí)時(shí)定量PCR儀(C 1000TM Thermal Cycler,美國BIO-RAD公司),超微量核酸蛋白測(cè)定儀(NANO DROP 2000C,美國Thermo公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 MTT法檢測(cè)不同肝毒性化學(xué)物質(zhì)對(duì)2種細(xì)胞的生長抑制作用

    將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以密度為6 000個(gè)·孔-1接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h。次日,每孔加入不同濃度的受試物溶液,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,使其最大濃度均為1 000 μmol·L-1(即鹽酸胺碘酮682 mg·L-1,鹽酸四環(huán)素444 mg·L-1,雙氯芬酸鈉296 mg·L-1,利福平823 mg·L-1,他莫昔芬372 mg·L-1,檸檬酸鈉294 mg·L-1,抗壞血酸176 mg·L-1,地塞米松392 mg·L-1),并依次3倍向下稀釋4個(gè)濃度。然后,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用MTT法檢測(cè)各孔吸光度,并計(jì)算各濃度受試物對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用,用SPSS 20.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

    1.3.2 高內(nèi)涵檢測(cè)肝毒性機(jī)制相關(guān)參數(shù)的變化

    以3種熒光探針的組合方式進(jìn)行高內(nèi)涵試驗(yàn)。分別為Hoechst 33342(藍(lán)色)/DCFH-DA(綠色)/MitoTrackerDeep Red FM(紅色);Hoechst 33342(藍(lán)色)/DIOC6(3)(綠色);mBBR(綠色)3種。

    將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以5 000 個(gè)·孔-1接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,次日,每孔加入不同濃度的受試物,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。肝毒性陽性化學(xué)物質(zhì)(簡稱陽性物)鹽酸胺碘酮、雙氯芬酸鈉、利福平、鹽酸四環(huán)素和他莫昔芬作用的最大濃度均約為IC50值,依次以2倍濃度梯度向下再稀釋4個(gè)濃度。肝毒性陰性化學(xué)物質(zhì)(簡稱陰性物)檸檬酸三鈉、抗壞血酸和地塞米松的給藥濃度與MTT法相同。然后,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h用于檢測(cè)。檢測(cè)時(shí),棄去培養(yǎng)板內(nèi)的液體,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一次,棄去PBS后,在96孔板中每孔加入50 μL不同熒光探針混合液,37 ℃避光孵育20 min。孵育結(jié)束后棄去96孔板內(nèi)液體,用PBS清洗一次后每孔再加入50 μL PBS,將96孔板置于高內(nèi)涵儀器中掃板檢測(cè),得到每個(gè)孔不同參數(shù)的平均熒光強(qiáng)度值,并根據(jù)各個(gè)參數(shù)陰性物與空白對(duì)照組平均熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算出陰性閾。

    其中,對(duì)于呈劑量依賴性增加的指標(biāo),忽略陰性閾的下限,按式(1)計(jì)算陰性閾:

    陰性閾=熒光強(qiáng)度比值的平均值+熒光強(qiáng)度

    比值的標(biāo)準(zhǔn)差

    (1)

    對(duì)于呈劑量依賴性減少的指標(biāo),忽略陰性閾的上限,按式(2)計(jì)算陰性閾:

    陰性閾=熒光強(qiáng)度比值的平均值-熒光強(qiáng)度

    比值的標(biāo)準(zhǔn)差

    (2)

    各機(jī)制參數(shù)的精確度、靈敏度和準(zhǔn)確度計(jì)算方法為:

    精確度 = (TP + TN)/(TP + TN + FP + FN)

    (3)

    靈敏度 = TP/(TP + FN)

    (4)

    特異度 = TN/(TN + FP)

    (5)

    式中:TP表示與陽性物已知肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)變化為陽性的個(gè)數(shù);FP表示與陽性物已知肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)變化為陰性的個(gè)數(shù);TN表示與陰性物已知肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)變化為陰性的個(gè)數(shù);FN表示與陰性物已知肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)變化為陽性的個(gè)數(shù)。

    1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞肝毒性化學(xué)成分的代謝酶mRNA的相對(duì)表達(dá)含量

    將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以20萬個(gè)·孔-1接種于6孔板中,24 h后從CO2培養(yǎng)箱中取出,胰酶消化后離心收集細(xì)胞于離心筒中,用1 mL PBS重懸后轉(zhuǎn)移至無酶的1.5 mL EP管中,3 000 r·min-1離心10 min后棄去上清。參照說明書操作步驟提取總RNA,核酸測(cè)定儀在波長260 nm和280 nm測(cè)定吸光度A260和A280,以上述總RNA為模板,參照說明書操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得的cDNA于-20 ℃保存。

    參照說明書設(shè)定PCR程序,每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)管。根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算出每個(gè)目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。本研究所用到的引物序列如表1所示。

    1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析與數(shù)據(jù)處理

    所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果來源于至少3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn),并表示為mean ± SD,精確度、靈敏度和特異度實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn),其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

    2 結(jié)果(Results)

    2.1 不同肝毒性化學(xué)成分對(duì)2種細(xì)胞的生長抑制作用

    通過MTT法評(píng)價(jià)了8種化合物對(duì)2種細(xì)胞的生長抑制作用(表2)。結(jié)果表明,5種陽性物對(duì)2種細(xì)胞均呈現(xiàn)出不同程度的體外生長抑制作用,且L-02細(xì)胞的IC50值均不同程度地小于HepG2細(xì)胞。而陰性物并無抑制作用或者僅有輕度的抑制作用。

    2.2 高內(nèi)涵檢測(cè)不同肝毒性的化學(xué)成分對(duì)2種細(xì)胞肝損傷機(jī)制相關(guān)參數(shù)的影響

    各陽性物以IC50近似值為最大給藥濃度作用于2種細(xì)胞時(shí),6種與肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)均出現(xiàn)不同程度的變化。高內(nèi)涵檢測(cè)結(jié)果顯示,雙氯芬酸鈉、鹽酸四環(huán)素和他莫昔芬作用于HepG2細(xì)胞時(shí),均可引起活性氧的大量產(chǎn)生、線粒體膜電位的降低和谷胱甘肽含量的減少。同時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)一定程度的損傷,細(xì)胞核DNA含量增加,細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、固縮,細(xì)胞可能發(fā)生凋亡。而鹽酸胺碘酮作用于HepG2細(xì)胞時(shí)線粒體膜電位沒有明顯降低,利福平作用于HepG2細(xì)胞時(shí)谷胱甘肽含量沒有明顯變化。與此同時(shí),雙氯芬酸鈉、利福平和他莫昔芬作用于L-02細(xì)胞時(shí),也可引起活性氧的大量產(chǎn)生、線粒體膜電位的降低和谷胱甘肽的減少。同時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)一定程度的損傷,細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、固縮,細(xì)胞可能發(fā)生凋亡。而鹽酸胺碘酮作用于L-02細(xì)胞時(shí)除線粒體膜電位沒有明顯降低外,細(xì)胞核也沒有發(fā)生變化,鹽酸四環(huán)素作用于L-02細(xì)胞時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沒有出現(xiàn)明顯損傷(圖1)。

    此外,我們根據(jù)各機(jī)制參數(shù)的陰性閾,得到了陽性物每個(gè)機(jī)制參數(shù)的最小中毒濃度(minimum toxic concentration, MTC),即最初設(shè)置的5個(gè)濃度中超過陰性域的最小濃度(表3和表4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各陽性物作用于2種細(xì)胞時(shí),MTC結(jié)果與高內(nèi)涵圖片反映出的結(jié)果基本一致。而陰性物作用于2種細(xì)胞時(shí),各機(jī)制參數(shù)均無明顯變化。

    表1 PCR試驗(yàn)所用的引物序列Table 1 Primers used in real-time PCR

    表2 化合物對(duì)2種肝細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)(均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=3)Table 2 The 50% inhibiting concentration (IC50) of different chemicals in two cell lines (mean ± SD, n=3)

    圖1 化合物處理肝細(xì)胞系后的高內(nèi)涵(HCS)分析圖像注:ROS表示活性氧,MMP表示線粒體膜電位,ER表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷,GSH表示谷胱甘肽;nuclei-藍(lán)/ROS-綠/MMP-紅,nuclei-藍(lán)/ER-綠,GSH-綠;對(duì)于HepG2細(xì)胞,胺碘酮50 μmol·L-1(34 mg·L-1),雙氯芬酸鈉150 μmol·L-1(44 mg·L-1),利福平200 μmol·L-1(165 mg·L-1),四環(huán)素150 μmol·L-1(67 mg·L-1),他莫昔芬50 μmol·L-1(19 mg·L-1);對(duì)于L-02細(xì)胞,胺碘酮20 μmol·L-1(14 mg·L-1),雙氯芬酸鈉150 μmol·L-1(44 mg·L-1),利福平150 μmol·L-1(123 mg·L-1),四環(huán)素150 μmol·L-1(67 mg·L-1),他莫昔芬20 μmol·L-1(7 mg·L-1);比例尺為50 μm。Fig. 1 The high content screening (HCS) images were obtained from the same well of cell line treated with five chemicals by using different filters to detectNote: ROS stands for reactive oxygen species; MMP stands for mitochondrial membrane potential; ER stands for endoplasmic reticulum; GSH stands for glutathione; nuclei-blue/ROS-green/MMP-red, nuclei-blue/ER-green, GSH-green; HepG2 cells treated with amiodarone 50 μmol·L-1 (34 mg·L-1), diciofenac sodium 150 μmol·L-1(44 mg·L-1), rifampicin 200 μmol·L-1(165 mg·L-1), tetracycline 150 μmol·L-1 (67 mg·L-1), tomoxifen 50 μmol·L-1(19 mg·L-1); L-02 cells treated with amiodarone 20 μmol·L-1(14 mg·L-1), diciofenac sodium 150 μmol·L-1(44 mg·L-1), rifampicin 150 μmol·L-1(123 mg·L-1), tetracycline 150 μmol·L-1(67 mg·L-1), tomoxifen 20 μmol·L-1(7 mg·L-1); Scale bar = 50 μm.

    2.3 不同肝細(xì)胞模型預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷能力的比較

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,2種細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的精確度、靈敏度和特異度均存在顯著性差異,且L-02細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的精確度、靈敏度和特異度均顯著高于HepG2細(xì)胞(表5)。這表明L-02細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的能力更強(qiáng)。

    表3 高內(nèi)涵檢測(cè)中受試化合物對(duì)HepG2細(xì)胞的最小毒性濃度(MTC)Table 3 Minimum toxic concentration (MTC) of tested chemicals in HepG2 cells in HCS test

    表4 高內(nèi)涵檢測(cè)中受試化合物對(duì)L-02細(xì)胞的MICTable 4 MIC of tested chemicals in L-02 cells in HCS test

    表5 2種肝細(xì)胞系在高內(nèi)涵檢測(cè)中的預(yù)測(cè)能力Table 5 Predictive ability of two liver cell lines detected with HCS

    2.4 2種肝細(xì)胞的藥物代謝酶mRNA表達(dá)含量比較

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與HepG2細(xì)胞相比,L-02細(xì)胞各個(gè)肝毒性化學(xué)成分代謝酶的mRNA表達(dá)水平均顯著增加。其中,L-02細(xì)胞Ⅱ相肝毒性化學(xué)成分代謝酶UGT1A1和GSTA1/2的mRNA表達(dá)含量增加最為顯著,分別約為HepG2細(xì)胞的12倍和9倍。這表明,L-02細(xì)胞相對(duì)于HepG2細(xì)胞高表達(dá)肝毒性化學(xué)成分代謝相關(guān)的酶類,可能與體內(nèi)肝臟代謝水平更加接近(圖2)。

    圖2 L-02與HepG2細(xì)胞中代謝酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量(均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=3)注:*P<0.05、**P<0.01表示與HepG2相比差異顯著。Fig. 2 The relative mRNA expression of metabolizing enzyme in L-02 cells and HepG2 cells (mean ± SD, n=3)Note: *, ** indicate significance at P<0.05 and P<0.01 compared with HepG2 cells.

    3 討論(Discussion)

    Livertox Database數(shù)據(jù)庫詳細(xì)介紹了能夠?qū)е赂味拘运幬锏乃幚砘钚裕湓谑褂脮r(shí)與肝損傷發(fā)生的因果關(guān)系、導(dǎo)致肝損傷發(fā)生的頻率和肝損傷的機(jī)制及類型等。而本研究所選的陽性藥(鹽酸胺碘酮、雙氯芬酸鈉、利福平、鹽酸四環(huán)素和他莫昔芬)均為Livertox Database里藥物列表中明確會(huì)導(dǎo)致藥物性肝損傷的藥物,陰性藥(檸檬酸三鈉、抗壞血酸和地塞米松)均為臨床上沒有與肝損傷相關(guān)的任何報(bào)道的藥物,上述8種藥物分別作為工具化合物用于評(píng)價(jià)篩選體系[11-12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)陰性物作用于2種細(xì)胞時(shí),2種細(xì)胞均呈現(xiàn)出較低程度的生長抑制。而當(dāng)陽性物作用于2種細(xì)胞時(shí),2種細(xì)胞均受到不同程度較強(qiáng)的生長抑制作用。L-02細(xì)胞對(duì)陽性物的敏感程度均大于HepG2細(xì)胞,且鹽酸胺碘酮和他莫昔芬這2種陽性物作用時(shí)更加明顯,L-02細(xì)胞的敏感性約為HepG2細(xì)胞的2倍以上。本研究的MTT實(shí)驗(yàn)中,3種陰性藥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致,IC50均>1 000 μmol·L-1,而5種陽性藥作用于2種細(xì)胞時(shí)的IC50值與已有文獻(xiàn)報(bào)道雖不完全一致,但均相差不大且在同一數(shù)量級(jí),此外本研究中的MTT法實(shí)驗(yàn)均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔,標(biāo)準(zhǔn)差較小,因此,本研究的MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果是準(zhǔn)確的[10]。根據(jù)MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以初步判斷L-02細(xì)胞可能比HepG2細(xì)胞對(duì)能夠?qū)е赂味拘曰瘜W(xué)成分性肝損傷的化學(xué)成分更敏感。

    為了進(jìn)一步比較2種細(xì)胞的預(yù)測(cè)能力,采用了高內(nèi)涵檢測(cè)的方法。大量研究表明,在高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)參數(shù)變化超過陰性域時(shí)的給藥濃度小于該肝毒性化合物最大血藥濃度(Cmax)的100倍時(shí),可以認(rèn)為其具有肝毒性[13]。根據(jù)MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果,測(cè)得的各個(gè)陽性物的IC50值均在其Cmax的100倍以內(nèi),因此,在此濃度范圍內(nèi)能夠正確篩出陽性物的機(jī)制參數(shù)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)陰性物作用于2種細(xì)胞時(shí),各參數(shù)的變化情況均小于空白組的20%,根據(jù)陰性物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,計(jì)算出了各個(gè)機(jī)制相關(guān)參數(shù)的陰性域,即在陰性域范圍內(nèi)變化為陰性,而在陰性域范圍外變化為陽性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,當(dāng)5種陽性物作用于2種細(xì)胞時(shí),除個(gè)別參數(shù)外,各機(jī)制參數(shù)變化時(shí),整體來看L-02細(xì)胞的最小中毒濃度較小,說明L-02細(xì)胞對(duì)肝毒性機(jī)制的變化更加敏感[14]。為了能更準(zhǔn)確和更直觀地比較2種細(xì)胞模型對(duì)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的預(yù)測(cè)能力,根據(jù)高內(nèi)涵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算并比較了2種細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的精確度、靈敏度和特異度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,L-02細(xì)胞的精確度、敏感度和特異度均顯著高于HepG2細(xì)胞,這表明L-02細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的能力更強(qiáng)。高內(nèi)涵試驗(yàn)可以多端點(diǎn)且準(zhǔn)確地檢測(cè)出肝損傷的機(jī)制。在今后的研究中,筆者會(huì)通過陽性藥和陰性藥的高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定肝損傷的評(píng)分和判定標(biāo)準(zhǔn),以用來大規(guī)模篩選出環(huán)境中能夠?qū)е赂螕p傷的化學(xué)物質(zhì)。

    肝藥酶的含量也是比較2種細(xì)胞與生理水平接近程度的有效方法,采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法評(píng)價(jià)了2種細(xì)胞的肝毒性化學(xué)成分代謝酶在mRNA水平的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,L-02細(xì)胞肝毒性化學(xué)成分代謝酶的mRNA表達(dá)水平均不同程度地顯著高于HepG2細(xì)胞。

    以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,2種細(xì)胞均能正確區(qū)分出能夠?qū)е赂螕p傷的化學(xué)物質(zhì),且L-02細(xì)胞對(duì)能夠?qū)е赂螕p傷化學(xué)物質(zhì)的敏感性優(yōu)于HepG2細(xì)胞。與HepG2細(xì)胞相比,L-02細(xì)胞預(yù)測(cè)藥物性肝損傷的準(zhǔn)確度、敏感度和特異度更高,且L-02細(xì)胞的肝藥酶含量高于HepG2細(xì)胞。高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)與MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明L-02細(xì)胞更適合作為肝損傷篩選模型,因其能夠?qū)崿F(xiàn)多端點(diǎn)、快速和高通量篩選,所以可以使用單一的高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)作為肝損傷的篩選方法。因此,L-02細(xì)胞結(jié)合高內(nèi)涵可作為預(yù)測(cè)藥物性肝損傷的最佳模型。

    猜你喜歡
    化學(xué)物質(zhì)毒性陰性
    第1講 身邊的化學(xué)物質(zhì)
    第1講 身邊的化學(xué)物質(zhì)
    動(dòng)物之最——毒性誰最強(qiáng)
    第1講 身邊的化學(xué)物質(zhì)
    鉬靶X線假陰性乳腺癌的MRI特征
    身邊的化學(xué)物質(zhì)
    三陰性乳腺癌的臨床研究進(jìn)展
    RGD肽段連接的近紅外量子點(diǎn)對(duì)小鼠的毒性作用
    hrHPV陽性TCT陰性的婦女2年后隨訪研究
    PM2.5中煤煙聚集物最具毒性
    国产精品熟女久久久久浪| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产亚洲精品久久久久5区| 黑丝袜美女国产一区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| e午夜精品久久久久久久| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 1024香蕉在线观看| 两性夫妻黄色片| 欧美另类一区| 一级a爱视频在线免费观看| 午夜福利视频在线观看免费| 丝袜美腿诱惑在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av一本久久久久| 在现免费观看毛片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产又色又爽无遮挡免| 电影成人av| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久网色| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 色综合欧美亚洲国产小说| av国产久精品久网站免费入址| 欧美日韩黄片免| 国产午夜精品一二区理论片| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日韩av免费高清视频| 午夜91福利影院| 老司机靠b影院| 国产精品国产av在线观看| 久久99一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 国产成人免费无遮挡视频| 在线观看www视频免费| 另类亚洲欧美激情| 久久性视频一级片| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美日韩精品网址| 亚洲成人国产一区在线观看 | 黄色视频在线播放观看不卡| 国产淫语在线视频| 中国美女看黄片| 亚洲欧洲日产国产| 国产亚洲av高清不卡| 久热这里只有精品99| 伊人亚洲综合成人网| 美女扒开内裤让男人捅视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲美女黄色视频免费看| av天堂久久9| 少妇 在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 看十八女毛片水多多多| 成年美女黄网站色视频大全免费| 91国产中文字幕| 各种免费的搞黄视频| av国产精品久久久久影院| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线 av 中文字幕| 老汉色∧v一级毛片| 麻豆乱淫一区二区| 午夜激情av网站| 亚洲精品日本国产第一区| 美女视频免费永久观看网站| 免费黄频网站在线观看国产| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 两人在一起打扑克的视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 黄色a级毛片大全视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 99热国产这里只有精品6| 男女国产视频网站| 亚洲av片天天在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品成人在线| 天堂8中文在线网| 婷婷成人精品国产| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 亚洲精品乱久久久久久| 精品福利观看| 国产又色又爽无遮挡免| 女警被强在线播放| 在线 av 中文字幕| 亚洲久久久国产精品| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品久久午夜乱码| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产成人精品无人区| 亚洲欧洲日产国产| 欧美成人午夜精品| 91精品三级在线观看| 女警被强在线播放| 成年人午夜在线观看视频| 精品一品国产午夜福利视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 中文字幕高清在线视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩一本色道免费dvd| 国产人伦9x9x在线观看| 免费看av在线观看网站| 香蕉丝袜av| 久久久国产一区二区| 亚洲专区国产一区二区| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 高清欧美精品videossex| 日韩视频在线欧美| 又大又爽又粗| 在线观看免费高清a一片| 自线自在国产av| 亚洲九九香蕉| 国产精品 欧美亚洲| 国产亚洲av高清不卡| 国产在线视频一区二区| 啦啦啦在线观看免费高清www| a 毛片基地| 国产伦理片在线播放av一区| 国产一区二区在线观看av| 99国产精品一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 男女高潮啪啪啪动态图| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲熟女毛片儿| 国产真人三级小视频在线观看| 五月开心婷婷网| 免费看十八禁软件| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品第二区| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品国产av在线观看| 电影成人av| 亚洲国产欧美在线一区| 丝袜美足系列| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 成人午夜精彩视频在线观看| 九草在线视频观看| 叶爱在线成人免费视频播放| av天堂在线播放| 天天添夜夜摸| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av在线播放精品| 成人国产一区最新在线观看 | 亚洲免费av在线视频| 亚洲av片天天在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 中文字幕人妻丝袜制服| 青草久久国产| 午夜免费鲁丝| 国产日韩欧美视频二区| 久热这里只有精品99| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 大香蕉久久网| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 少妇人妻 视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 黄色 视频免费看| 国产午夜精品一二区理论片| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 国产精品 欧美亚洲| 高清欧美精品videossex| 亚洲成人免费av在线播放| 免费高清在线观看日韩| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美日韩av久久| 午夜福利,免费看| 久久九九热精品免费| 欧美大码av| 美国免费a级毛片| 国产日韩欧美在线精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲av美国av| 18在线观看网站| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产片特级美女逼逼视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人av教育| 国产成人a∨麻豆精品| 国产一级毛片在线| 日韩电影二区| 男女之事视频高清在线观看 | 精品国产乱码久久久久久男人| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 在线观看免费高清a一片| 国产在线一区二区三区精| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久国产一区二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产不卡av网站在线观看| 国产黄频视频在线观看| 国产av国产精品国产| 亚洲伊人色综图| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品免费大片| 久久国产精品影院| 99re6热这里在线精品视频| 日本一区二区免费在线视频| 久久精品国产综合久久久| 丁香六月天网| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 美女国产高潮福利片在线看| 新久久久久国产一级毛片| 男女床上黄色一级片免费看| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 久久国产精品影院| 黄片小视频在线播放| 国产精品免费大片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 成人午夜精彩视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产亚洲欧美精品永久| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产精品国产av在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 久久久精品94久久精品| 亚洲精品国产av成人精品| 久久久国产欧美日韩av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲免费av在线视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美激情极品国产一区二区三区| 七月丁香在线播放| 99国产精品一区二区三区| 日本91视频免费播放| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲熟女毛片儿| 纯流量卡能插随身wifi吗| 波野结衣二区三区在线| 亚洲av男天堂| 好男人视频免费观看在线| 国产日韩欧美视频二区| 高清视频免费观看一区二区| 日本午夜av视频| 久久青草综合色| www.自偷自拍.com| 叶爱在线成人免费视频播放| 夫妻午夜视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av有码第一页| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲少妇的诱惑av| 男女下面插进去视频免费观看| 国产高清videossex| 麻豆乱淫一区二区| 捣出白浆h1v1| 久久这里只有精品19| 99国产精品一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久9热在线精品视频| 亚洲一区中文字幕在线| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产不卡av网站在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲国产av影院在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 五月天丁香电影| 成人免费观看视频高清| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲国产看品久久| 首页视频小说图片口味搜索 | 一边亲一边摸免费视频| 在线观看人妻少妇| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜91福利影院| www.av在线官网国产| 在线观看国产h片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 在线av久久热| 97在线人人人人妻| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美精品一区二区免费开放| 免费看av在线观看网站| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久国产精品影院| 伊人亚洲综合成人网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 九草在线视频观看| 丁香六月欧美| www.999成人在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 首页视频小说图片口味搜索 | 夫妻午夜视频| 考比视频在线观看| svipshipincom国产片| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲国产av影院在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 在线看a的网站| 亚洲欧美一区二区三区久久| 黑丝袜美女国产一区| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品人人爽人人爽视色| 大片免费播放器 马上看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产有黄有色有爽视频| 视频区图区小说| 美女国产高潮福利片在线看| 赤兔流量卡办理| 午夜激情久久久久久久| 搡老乐熟女国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲欧美清纯卡通| 午夜福利,免费看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 黄频高清免费视频| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品久久久久久精品电影小说| 看十八女毛片水多多多| av网站在线播放免费| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久影院123| 秋霞在线观看毛片| 欧美日韩综合久久久久久| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲精品国产av成人精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产亚洲av高清不卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国精品久久久久久国模美| 国产又爽黄色视频| 久久九九热精品免费| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 久久久久久久大尺度免费视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩电影二区| 亚洲国产av新网站| 久久久精品区二区三区| 亚洲九九香蕉| 一级毛片女人18水好多 | www.精华液| 亚洲精品一区蜜桃| 大香蕉久久成人网| 咕卡用的链子| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产欧美亚洲国产| 一边亲一边摸免费视频| www.自偷自拍.com| 国产精品偷伦视频观看了| av不卡在线播放| 国产欧美日韩精品亚洲av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 午夜精品国产一区二区电影| 丝袜人妻中文字幕| 高清欧美精品videossex| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产一卡二卡三卡精品| 最新的欧美精品一区二区| 男女边吃奶边做爰视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产黄色免费在线视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 天天影视国产精品| 视频区图区小说| 妹子高潮喷水视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一级毛片女人18水好多 | bbb黄色大片| 一级黄色大片毛片| 久久人妻熟女aⅴ| 日日夜夜操网爽| 另类亚洲欧美激情| 色综合欧美亚洲国产小说| 成人国产一区最新在线观看 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲av日韩在线播放| 丝袜脚勾引网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 成人黄色视频免费在线看| 中文字幕制服av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产成人av教育| 男女午夜视频在线观看| 91麻豆av在线| 国产一卡二卡三卡精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| 色网站视频免费| 国产精品熟女久久久久浪| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产一区有黄有色的免费视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 免费看不卡的av| 丰满迷人的少妇在线观看| 考比视频在线观看| 成人三级做爰电影| 日日爽夜夜爽网站| 国产在视频线精品| 午夜福利乱码中文字幕| 日本午夜av视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久久精品人妻al黑| 欧美久久黑人一区二区| 国产不卡av网站在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产又爽黄色视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 自线自在国产av| 一二三四在线观看免费中文在| 免费高清在线观看日韩| 丁香六月欧美| www.999成人在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 日韩电影二区| 亚洲成国产人片在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 国产色视频综合| 秋霞在线观看毛片| 一级,二级,三级黄色视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 久久久国产欧美日韩av| 少妇人妻久久综合中文| 999久久久国产精品视频| 大香蕉久久成人网| 亚洲欧美激情在线| 十八禁人妻一区二区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人精品久久二区二区91| 老司机影院成人| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一边亲一边摸免费视频| 丝袜喷水一区| 亚洲av男天堂| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99精品久久久久人妻精品| 性色av一级| 1024视频免费在线观看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲,欧美精品.| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产一区亚洲一区在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜精品国产一区二区电影| 丝袜人妻中文字幕| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 精品第一国产精品| 久热这里只有精品99| www.精华液| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美中文综合在线视频| 国产成人系列免费观看| 性少妇av在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产在视频线精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 色播在线永久视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 亚洲av在线观看美女高潮| av片东京热男人的天堂| 91成人精品电影| 中文字幕色久视频| 午夜福利视频在线观看免费| 最新在线观看一区二区三区 | 高清黄色对白视频在线免费看| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产xxxxx性猛交| 欧美精品av麻豆av| 五月开心婷婷网| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久九九热精品免费| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 搡老乐熟女国产| 免费高清在线观看日韩| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品人妻在线不人妻| 脱女人内裤的视频| 天堂中文最新版在线下载| 在线观看www视频免费| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品一二三| 9191精品国产免费久久| 精品免费久久久久久久清纯 | 中文字幕人妻熟女乱码| www日本在线高清视频| 欧美激情高清一区二区三区| 热re99久久国产66热| 亚洲av电影在线进入| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品熟女久久久久浪| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 蜜桃国产av成人99| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 乱人伦中国视频| 首页视频小说图片口味搜索 | 男女边吃奶边做爰视频| 黄片小视频在线播放| 久久久久久久精品精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日本av手机在线免费观看| 看十八女毛片水多多多| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲熟女精品中文字幕| 丝瓜视频免费看黄片| 免费不卡黄色视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 多毛熟女@视频| 久久久精品免费免费高清| 精品一区在线观看国产| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲色图综合在线观看| 色网站视频免费| 老司机亚洲免费影院| 又大又爽又粗| 国产一级毛片在线| 日本vs欧美在线观看视频| 尾随美女入室| 色婷婷久久久亚洲欧美| 视频区图区小说| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 成人黄色视频免费在线看| av欧美777| 精品国产国语对白av| 中文欧美无线码| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产成人a∨麻豆精品| 国产成人影院久久av| 男女午夜视频在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美 日韩 精品 国产| √禁漫天堂资源中文www| 成在线人永久免费视频| 亚洲av综合色区一区| 婷婷丁香在线五月| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲中文字幕日韩| 香蕉国产在线看| 午夜福利乱码中文字幕| 午夜91福利影院| 男人操女人黄网站| 两个人免费观看高清视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| h视频一区二区三区| 国产免费视频播放在线视频| 男女边摸边吃奶| 少妇精品久久久久久久| 在线观看国产h片| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产精品欧美亚洲77777| 国产有黄有色有爽视频| 中文字幕亚洲精品专区| 国产激情久久老熟女| 国产精品av久久久久免费| 咕卡用的链子| 美女主播在线视频| 国产欧美日韩一区二区三 | 丰满饥渴人妻一区二区三| e午夜精品久久久久久久| 成年人免费黄色播放视频| 欧美成人午夜精品|