不明原因發(fā)熱患者肺泡灌洗液病毒群落解析

李欣霖，劉齊，陳旭，肖宇晴，楊世興，張文，陳建國

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

不明原因發(fā)熱是指持續(xù)發(fā)熱3周以上，多次測得體溫超過38℃，入院檢查1周仍然沒有明確原因的發(fā)熱[1]。不明原因發(fā)熱病因復(fù)雜多樣，缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，同時容易受到治療藥物的影響，通過常規(guī)的檢測手段很難確診。能夠?qū)е虏幻髟虬l(fā)熱的病因多達(dá)200多種，主要包括感染性疾病、結(jié)締組織病、腫瘤性疾病等，其中以感染性疾病為主，而肺部感染又占有較大比例[2]。病毒作為肺部感染的重要病原體之一，是引起發(fā)熱的重要原因[3]。目前對于病毒的檢測，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、免疫學(xué)方法以及分子生物學(xué)方法發(fā)揮了重要的作用，但病毒分離培養(yǎng)效率較慢，分子生物學(xué)方法例如PCR技術(shù)只能檢測出已知序列的病毒，對于新型病毒的檢測具有較大局限性，而病毒宏基因組學(xué)利用高通量測序技術(shù)可以對樣本中幾乎所有核酸序列進(jìn)行測定，不僅可以分析樣品中病毒群落組成，還能夠監(jiān)測某些致病性病毒的變化情況，并能提前發(fā)現(xiàn)潛在的新型致病性病原體。本研究采用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)對不明原因發(fā)熱患者肺泡灌洗液中的病毒群落進(jìn)行初步解析，探討肺部病毒群落與不明原因發(fā)熱之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 肺泡灌洗液樣本的采集

收集2018年6月至2019年4月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院診治的不明原因發(fā)熱患者(平均年齡67歲)肺泡灌洗液樣本共80份，其中58份樣本用于文庫構(gòu)建，文庫構(gòu)建后繼續(xù)收集22份肺泡灌洗液用于陽性樣本篩選，并采集40份健康者咽拭子作為陰性對照。均使用一次性無菌用具采集后于-20 ℃冷凍運輸至實驗室。用1.5 mL無RNA酶的EP管從每份樣本中吸取1 mL肺泡灌洗液，于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒宏基因組文庫構(gòu)建及深度測序

1.2.1 高通量文庫的構(gòu)建[4-5]樣本處理：從-80 ℃冰箱中取出樣本置于冰上備用，振蕩15 min，12 000×g離心10 min，吸取上清液200 μL至另一新1.5 mL無RNA酶 EP管中，保存待用。將58個樣本共分為5個文庫，1號、2號、3號文庫分別由12個樣本組成，各樣本吸取41.7 μL混合制備成500 μL體系；4號、5號文庫分別由11個樣本組成，各樣本吸取45.5 μL混合制備成500 μL體系。過膜除去微小顆粒物質(zhì)。利用核酸消化酶(美國Life Technologic公司)去除各文庫中無蛋白衣殼保護(hù)的游離核酸，使用MiniBEST 病毒核酸提取試劑盒(日本TaKaRa公司)提取樣本中的病毒核酸，采用SuperScript Ⅳ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Life Technologic公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將文庫中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用Klenow酶(美國New England Biolabs公司)將單鏈DNA合成雙鏈DNA，用于文庫的構(gòu)建。高通量測序文庫的構(gòu)建采用Nextera XT DNA 樣品制備試劑盒(美國Illumina公司)。

1.2.2 文庫的擴增、純化與測序 利用二代測序接頭引物試劑盒(美國Illumina公司)將合成后的DNA加上接頭后進(jìn)行擴增，接著采用QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒(德國Qiagen公司)對擴增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并采用Agencourt AMPure XP文庫篩選試劑盒(美國Beckman公司)除去文庫中小的DNA片段和引物二聚體，從而獲得長度在300～800 bp的DNA文庫，送至上海生工生物有限公司Illumina Miseq測序平臺進(jìn)行深度測序。

1.2.3 文庫測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析 通過Miseq平臺對文庫進(jìn)行測序并對測序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測，保留質(zhì)檢合格的測序數(shù)據(jù)后借助Vendor軟件將原始數(shù)據(jù)輸出，利用Bowite 2軟件除去原始數(shù)據(jù)中的真核及原核基因組序列后，再利用VecScreen軟件剪切掉序列兩端的引物和接頭，將所得序列進(jìn)行拼接，之后放入病毒蛋白組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast X搜索，最后將核酸序列按照病毒分類，以網(wǎng)頁的形式輸出。

1.3 病毒基因組擴增及陽性樣本篩選

1.3.1 肺泡灌洗液中病毒核酸的提取 陽性樣本篩選包括用于文庫構(gòu)建的58份肺泡灌洗液及22份后期采集的灌洗液共80份，使用MiniBEST病毒核酸提取試劑盒提取病毒核酸。

1.3.2 PCR引物設(shè)計及擴增測序 用Geneious 11軟件設(shè)計細(xì)環(huán)病毒及鼻病毒巢式引物，引物序列見表1。細(xì)環(huán)病毒 PCR外套反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共循環(huán)31次，擴增結(jié)束后72 ℃延伸5 min。內(nèi)套反應(yīng)退火溫度為55℃，其余條件同外套反應(yīng)。

鼻病毒PCR外套反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)35次，擴增結(jié)束后72 ℃延伸10 min。內(nèi)套反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)25次，擴增結(jié)束后72 ℃延伸10 min。

細(xì)環(huán)病毒和鼻病毒擴增均選用TaKaRa公司r-Taq酶體系，外套：r-Taq酶10 μL，DEPC水 8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，樣本 1 μL，共計20 μL體系。內(nèi)套：r-Taq酶25 μL，DEPC水 22 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，樣本1 μL，共計50 μL體系。最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗各陽性樣本，采用MiniBEST瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)對切下的目的片段進(jìn)行膠回收，并送Illumina MiSeq測序平臺測序。

表1 巢式PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 肺泡灌洗液文庫中病毒群落組成

高通量測序后的最終結(jié)果通過網(wǎng)頁的形式輸出，可以看到各個文庫中包含的各種病毒，包括各個病毒的科、屬、種以及每種病毒序列的最大重疊群堿基長度和序列條數(shù)。通過統(tǒng)計后可以得到各個文庫中的病毒群落組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1號文庫的病毒種類及所包含的病毒序列明顯少于其余文庫，同時在5個文庫中都存在的有圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Humanendogenousretrovirus,HERV)、藻去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、未分類病毒科(None)，而指環(huán)病毒科(Anelloviridae)、擬菌病毒科(Mimiviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)同時出現(xiàn)于多個文庫中。指環(huán)病毒科存在于第2號、3號、4號、5號文庫中，占有較大的比列，在2號、4號文庫中的序列數(shù)分別為1 249條和753條，明顯高于其他文庫，且在4號文庫中存在的最大重疊序列(Contig)長達(dá)2 199 bp。小RNA病毒科(Picornaviridae)僅存在于1號與4號文庫中，并且序列數(shù)低，分別為2條和3條。

將各病毒科的序列條數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計后對各文庫病毒群落進(jìn)行比較(表2)，與指環(huán)病毒科相關(guān)的序列數(shù)共2 207條(占總體45.0%)，圓環(huán)病毒科65條(1.3%)，藻去氧核糖核酸病毒科91條(1.9%)，人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科68條(1.4%)，逆轉(zhuǎn)錄病毒科14條(0.3%)，痘病毒科1 376條(28.1%)，帚狀病毒科660條(13.5%)，未分類病毒科336條(6.9%)，小RNA病毒科5條(0.1%)，其他病毒科78條(1.6%)。

將5個文庫中的病毒群落組成統(tǒng)計整理后并以餅狀圖展示(圖1)，可以直觀看出各個文庫中每個病毒所占比例，同時整理后得到5個肺泡灌洗液文庫中總體病毒群落組成：指環(huán)病毒科占19.4%，圓環(huán)病毒科占11.0%，藻去氧核糖核酸病毒科占11.0%，人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科占10.2%，痘病毒科占4.9%，逆轉(zhuǎn)錄病毒科占3.2%，帚狀病毒科(Virgaviridae)占2.3%，小RNA病毒科占0.6%，未分類病毒科占24.7%，虹彩病毒科、擬菌病毒科等其他病毒科共占12.7%。

表2 肺泡灌洗液文庫內(nèi)病毒相關(guān)序列數(shù)比較

A：1號文庫；B：2號文庫；C：3號文庫；D：4號文庫；E：5號文庫；F：1～5號文庫總體病毒群落組成

2.2 細(xì)環(huán)病毒陽性樣本篩選結(jié)果及系統(tǒng)進(jìn)化分析

指環(huán)病毒科在肺泡灌洗液病毒群落中所占比例最大，其中與細(xì)環(huán)病毒相關(guān)序列數(shù)最多，通過拼接延長后獲得的最大重疊序列為2 199 bp，故以該序列為模板設(shè)計PCR引物，在所有樣本中進(jìn)行細(xì)環(huán)病毒陽性樣本的篩選，電泳結(jié)果見圖2，其中陽性條帶位于370 bp左右的位置，共有9份陽性樣本，分別為26號、37號、38號、41號、46號、47號、72號、75號、76號。將陽性樣本切膠純化后測序，通過Blast N比對后均屬于細(xì)環(huán)病毒，陽性率為11.3%。而陰性對照中共篩選出細(xì)環(huán)病毒陽性樣本2份，陽性率為5.0%。

將各個文庫指環(huán)病毒科中序列條數(shù)較多的病毒通過拼接延長之后，共獲得4個細(xì)環(huán)病毒的開放閱讀框1(ORF1)氨基酸序列，分別表示為HTTVL1(MN893308)、HTTVL2(MN893309)、HTTVL3(MN893310)，它們分別存在于2號、3號、4號文庫中；HTTVL4(MN893311)為4號文庫中的細(xì)環(huán)病毒13型(torque teno virus 13)，根據(jù)他們的ORF1氨基酸序列構(gòu)建而成的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。從發(fā)育樹上可以看出，HTTVL1與來自美國肝炎患者的細(xì)

A：1～20號樣本；B：21～40號樣本；C：41～60號樣本；D：61～80號樣本。M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物

環(huán)病毒(AB017610)聚集，同源性為90.2%；HTTVL2與來自美國艾滋病患者血漿的細(xì)環(huán)病毒(ANQ39345)聚集，同源性為89.3%；HTTVL3與屬于未分類指環(huán)病毒中的細(xì)環(huán)病毒(AHN50432)聚集，且同源性為93.3%；HTTVL4與屬于甲型細(xì)環(huán)病毒屬(Alphatorquevirus)的細(xì)環(huán)病毒13型(YP009505717)聚集，同源性為86.1%。

圖3 基于細(xì)環(huán)病毒開放閱讀框1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 鼻病毒陽性樣本篩選結(jié)果

鼻病毒屬于小RNA科病毒，雖然僅在1號、4號文庫中存在，但鼻病毒是重要的呼吸道病毒。為了進(jìn)一步研究其與發(fā)熱的關(guān)系，根據(jù)鼻病毒VP4/VP2區(qū)域核苷酸序列設(shè)計巢式PCR引物進(jìn)行鼻病毒陽性樣本的篩選。電泳結(jié)果如圖4，共有8份陽性樣本，分別為41號、44號、46號、60號、70號、78號、79號、80號。將各陽性樣本純化后測序，再通過Blast N比對后得到41、44、60號屬于鼻病毒B型(rhinovirus B)，46、70、78、79號屬于鼻病毒A型(rhinovirus A)，80號未得到測序結(jié)果。

3 討論

病毒宏基因組學(xué)就是將樣品中所有的病毒與非病毒微生物分離后提取病毒核酸，運用高通量測序技術(shù)進(jìn)行深度測序，然后將測序所得結(jié)果同數(shù)據(jù)庫中病毒序列進(jìn)行比對，并利用相關(guān)軟件處理后得到研究樣本中的病毒群落組成[6]。病毒宏基因組學(xué)技術(shù)避開了傳統(tǒng)方法難以檢測到變異度高的新型病毒的局限性，不僅可以分析各種環(huán)境中病毒群落的組成，還能夠發(fā)現(xiàn)潛在新型病毒，為人類發(fā)掘新型病毒及診斷各種病毒性疾病提供了方法和技術(shù)支持。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物

指環(huán)病毒科病毒是一種無包膜、環(huán)狀、單鏈DNA病毒，基因組長度為2.1～3.9 kb[7]，基因組GC含量較高，一般含有3～4個開放閱讀框，可細(xì)分為細(xì)環(huán)病毒(TTV)，小細(xì)環(huán)病毒(torque teno mini virus, TTMV)，中細(xì)環(huán)病毒(torque teno midi virus, TTMDV)等[8-9]。指環(huán)病毒可以在許多不同宿主中被檢測到，包括人類、家畜、家禽等，雖然指環(huán)病毒在人類和動物中廣泛流行并被懷疑與某些人類或動物的疾病相關(guān)，具有較高的遺傳多樣性，但其病原學(xué)作用尚未明確[10-12]。在指環(huán)病毒家族中，細(xì)環(huán)病毒和中細(xì)環(huán)病毒被認(rèn)為與發(fā)熱有關(guān)[13]。本研究通過對所構(gòu)建的5個肺泡灌洗液文庫進(jìn)行深度測序，結(jié)果在各個文庫中均未檢測到常見的呼吸道病毒，例如呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、流感病毒等，而且1號文庫病毒種類明顯少于其他4個文庫。這可能與文庫中相應(yīng)的病毒滴度過低，或者文庫構(gòu)建不佳有關(guān)。文庫構(gòu)建過程中的過濾及核酸的消化對DNA產(chǎn)量有著較大的影響，而增加測序深度可以在一定程度上減少文庫對最終結(jié)果的影響。從病毒群落組成上看，除去未分類科病毒，文庫中的病毒群落以指環(huán)病毒科病毒為主體，占整體文庫的19.4%，其次為圓環(huán)病毒科、藻去氧核糖核酸病毒科、人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科、痘病毒科等。從各病毒序列數(shù)上看，指環(huán)病毒科序列數(shù)量在4個文庫中較高，占總體序列數(shù)的45.0%；痘病毒科存在于所有文庫中，是除指環(huán)病毒科之外序列數(shù)最多的病毒；5號文庫中帚狀病毒科序列數(shù)最多，為659條，2號文庫中僅有1條，其他3個文庫為0；小RNA病毒科僅存在于1號和4號文庫，并且序列數(shù)很少。

綜合分析后發(fā)現(xiàn)：指環(huán)病毒科病毒占總體文庫的19.4%，同時存在于4個文庫中，分布廣泛。從病毒種類來看，樣本中指環(huán)病毒所占比例明顯高于其他病毒科，從高通量測序結(jié)果上看，共產(chǎn)生了2 207條與指環(huán)病毒科有關(guān)的序列，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他病毒科，并且通過拼接組裝產(chǎn)生了4條較長的序列，具有進(jìn)一步分析研究的意義。文庫中痘病毒科病毒主要是牛痘病毒及猴痘病毒，分布于所有文庫中并且具有較多的序列數(shù)量。痘病毒可以通過接觸或呼吸道傳播，感染后可能出現(xiàn)發(fā)熱的癥狀，但是常伴有典型的皮膚癥狀[14]，易于鑒別診斷。本研究中痘病毒序列數(shù)量較多，但是拼接后產(chǎn)生的最大重疊序列僅有200～300 bp，通過Blast X比對后均未產(chǎn)生有意義的結(jié)果。帚狀病毒科病毒作為植物病毒，與其相關(guān)的序列數(shù)雖然較多，但是集中在5號文庫中，考慮可能是由實驗過程中的污染造成的。雖然圓環(huán)病毒科、藻去氧核糖核酸病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科也占有一定比例，但是與它們相關(guān)的序列數(shù)少，樣本中病毒滴度低，同時逆轉(zhuǎn)錄病毒普遍存在于人類基因組中，一般情況下無致病性，所以認(rèn)為這些病毒與不明原因發(fā)熱的相關(guān)性并不高。小RNA病毒僅存在于1號和4號文庫中，只占病毒總體的0.6%，并且其序列數(shù)較少，但小RNA病毒是病毒性肺炎的常見病原體之一[15]，為了探究其與疾病之間的關(guān)系，故同樣對其進(jìn)行陽性樣本篩選及分析。

本研究對5個肺泡灌洗液文庫進(jìn)行測序，結(jié)果表明指環(huán)病毒在2、3、4、5號文庫中所占比例較高，對測序結(jié)果進(jìn)行分析后通過Blast N比對后確定指環(huán)病毒科中以細(xì)環(huán)病毒為主，并且與其相關(guān)的序列數(shù)量及最大重疊序列均明顯高于其他病毒科。對用于文庫構(gòu)建的58份樣本進(jìn)行陽性篩選后，共發(fā)現(xiàn)6份細(xì)環(huán)病毒陽性樣本(10.3%)，后期采集的22份肺泡灌洗液樣本中篩選出陽性樣本3份(13.6%)。雖然不同時間段感染的病毒群落可能不完全相同，但后期收集的樣本僅用于流行病學(xué)分析，并且兩次取樣的陽性率是相似的,所以計算后80份樣本中細(xì)環(huán)病毒的陽性率為11.3%。因健康者肺泡灌洗液樣本較難獲取，而咽拭子中微生物種類與肺泡灌洗液相似[16]，故選取健康者咽拭子作為陰性對照，在40份咽拭子樣本中共有2份陽性，陽性率明顯低于肺泡灌洗液中細(xì)環(huán)病毒陽性率。既往有文獻(xiàn)對瑞士71例不明原因感染的肺移植患者的肺泡灌洗液及血液進(jìn)行病毒宏基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在患者血液和肺泡灌洗液中同時存在大量的細(xì)環(huán)病毒，并且病毒載量隨著患者免疫功能的下降而增多[17]。McElvania TeKippe等[13]報道在發(fā)熱兒童的血液中檢測到細(xì)環(huán)病毒，并且隨著體溫的升高細(xì)環(huán)病毒的檢出率也會隨之升高。對比既往相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)不論在血液或者是肺泡灌洗液中，細(xì)環(huán)病毒是一種容易被檢測到的病毒，并且病毒的載量會隨著患者發(fā)熱程度或是免疫情況的改變而發(fā)生變化。在本研究中細(xì)環(huán)病毒在不明原因發(fā)熱患者中的陽性率(11.3%)高于陰性對照中的陽性率(5.0%)，同時結(jié)合測序的結(jié)果，認(rèn)為不明原因的發(fā)熱與細(xì)環(huán)病毒存在一定的聯(lián)系。雖然細(xì)環(huán)病毒可以導(dǎo)致呼吸道疾病[18]，但并不認(rèn)為是由于細(xì)環(huán)病毒感染呼吸道而引起的發(fā)熱，可能是發(fā)熱在一定程度上為細(xì)環(huán)病毒的復(fù)制提供了一個良好的環(huán)境。同時患者多為高齡人群，免疫系統(tǒng)功能減弱及炎癥環(huán)境均可以促進(jìn)細(xì)環(huán)病毒的感染、增殖[17,19]。據(jù)報道細(xì)環(huán)病毒可以作為免疫功能低下的標(biāo)志[20]，但細(xì)環(huán)病毒感染是否可以導(dǎo)致肺炎及其致病性還有待研究。因指環(huán)病毒序列差異很大，所以基于指環(huán)病毒全基因組來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹是困難的[5]。指環(huán)病毒主要包含ORF1和ORF2，ORF1主要負(fù)責(zé)編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)，ORF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap)[21]。為了確定文庫中所測得的細(xì)環(huán)病毒序列與其他指環(huán)病毒的關(guān)系，我們根據(jù)ORF1氨基酸序列，在基因庫中進(jìn)行Blast N比對得到具有代表性的指環(huán)病毒，一同進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。分析后發(fā)現(xiàn)本研究中檢測到的4株細(xì)環(huán)病毒均屬于同一進(jìn)化分支，HTTVL1與細(xì)環(huán)病毒(AB017610)聚集，HTTVL2與細(xì)環(huán)病毒(ANQ39345)聚集，而HTTVL3的ORF1與細(xì)環(huán)病毒(AHN50432)的同源性最高，為93.3%，HTTVL4與細(xì)環(huán)病毒13型(YP009505717)聚集，它們分別來源于肝炎患者及艾滋病患者的血漿，并且測序所得的序列與基因庫中已知病毒序列的同源性皆為90.0%左右，可以看出它們與來自人類血漿的細(xì)環(huán)病毒高度同源。

小RNA病毒科是一種單股正鏈RNA病毒，其RNA本身就具有感染性[22]，是病毒性肺炎的常見病原體之一。該病毒科主要包括4個病毒屬：鼻病毒屬(rhinovirus)、腸道病毒屬(enterovirus)、心病毒屬(cardiovirus)和口瘡病毒屬(aphthovirus)[23]。本研究中鼻病毒僅存在于1號及4號文庫中，在所有樣本中陽性率為10%，但是文庫中病毒滴度很低，僅有5個序列，故考慮鼻病毒與不明原因發(fā)熱相關(guān)性不高。

綜上所述，本次研究利用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)對不明原因發(fā)熱患者肺泡灌洗液樣本中的病毒群落進(jìn)行了解析，病毒群落中指環(huán)病毒科占比最高，其中細(xì)環(huán)病毒與不明原因發(fā)熱存在一定關(guān)系。研究結(jié)果為不明原因發(fā)熱患者的診斷治療及進(jìn)一步相關(guān)研究提供了依據(jù)。