RAC1通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白1分布影響卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲

張璐玢，鄒雪琴，張鰍丹，高淑君，劉雪，潘玲麗，趙楊靜，梁秀婷，王薈,3，朱彥玲，邵啟祥,3

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬徐州醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 徐州 221005； 3. 江蘇省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

卵巢上皮細(xì)胞癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是高死亡率的婦科惡性腫瘤，在癌癥早期常迅速轉(zhuǎn)移至腹膜導(dǎo)致跨體腔轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響女性的身心健康[1]。小GTP酶Rac1(Rac family small GTPase 1，RAC1)是Rho蛋白家族成員之一，通過在活性狀態(tài)GTP-RAC1和非活性狀態(tài)GDP-RAC1間相互轉(zhuǎn)換，在腫瘤中發(fā)揮重要的分子開關(guān)作用[2]。作為細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)因子，RAC1可調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑、黏附、遷移、侵襲和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，RAC1在EOC患者組織標(biāo)本和細(xì)胞系中高表達(dá)，其表達(dá)水平與血清CA125、腫瘤病理分型和術(shù)后殘余腫瘤大小呈正相關(guān)，并預(yù)示患者不良預(yù)后，還通過上調(diào)波形蛋白和下調(diào)E-鈣黏蛋白促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)。

EMT是上皮細(xì)胞失去頂端-基底極性和細(xì)胞間黏附，發(fā)生間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的過程，常伴隨著上皮細(xì)胞間連接減弱、遷移和侵襲能力增加[5]。緊密連接蛋白1(tight junction protein 1，TJP1)是EMT過程中上皮樣細(xì)胞的標(biāo)志物，是最早被鑒定出的細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白，敲除TJP1會破壞細(xì)胞間的緊密連接[6]。鑒于TJP1是參與調(diào)控細(xì)胞EMT的重要分子，與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)，本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定敲減RAC1的卵巢癌細(xì)胞系，觀察敲減RAC1對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，并探究RAC1對TJP1表達(dá)和分布的調(diào)節(jié)作用，為闡明卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和人胚胎腎細(xì)胞系HEK-293T由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院周小明教授惠贈；人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院盧小東教授惠贈；所有細(xì)胞均采用含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL鏈霉素的高糖DMEM，置5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)、傳代。

1.1.2 主要試劑 DMEM和胎牛血清(美國Gibco公司)；嘌呤霉素和聚凝胺(上海YEASEN公司)；限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ、NcoⅠ和T4DNA連接酶(美國NEB公司)；PCR產(chǎn)物純化、膠回收和質(zhì)粒抽提試劑盒(上海生工公司)；RIPA裂解液和Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(上海碧云天公司)；鼠抗人RAC1抗體、基質(zhì)膠和Transwell小室(美國BD公司)；兔抗人TJP1抗體(美國Proteintech公司)；鼠抗人GAPDH抗體(南京貝迪公司)；HRP偶聯(lián)的抗小鼠/兔IgG(美國Cell Signal Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立穩(wěn)定敲減RAC1基因的卵巢癌細(xì)胞系

1.2.1.1RAC1shRNA目的片段的獲得 在美國Sigma Aldrich公司網(wǎng)站(https:∥www.sigmaaldrich.com)檢索獲得一對經(jīng)過驗證的人RAC1shRNA序列，正義鏈為5′-CCGGCGCAAACAGATGTGTTCTTAACTCGAGTTAAGAACACATCTGTTTGCGTTTTTG-3′，反義鏈為5′-AATTCAAAAACGCAAACAGATGTGTTCTTAACTCGAGTTAAGAACACATCTGTTTGCG-3′，由上海生工生物工程公司合成。按照下述體系和條件退火：10×NEB 緩沖液 5 μL，正義鏈和反義鏈各5 μL，無核酸酶水35 μL，95 ℃變性4 min，70 ℃退火10 min，緩慢降至室溫。

1.2.1.2 構(gòu)建RAC1shRNA慢病毒載體 將pLKO.1-puro慢病毒載體用AgeⅠ和EcoRⅠ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收7 kb處條帶。將目的片段與膠回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞擴增后，涂布于氨芐抗性的瓊脂板上，挑取單個菌落擴增并提取質(zhì)粒。

1.2.1.3 慢病毒包裝和感染靶細(xì)胞 將RAC1shRNA慢病毒載體和輔助質(zhì)粒(psPAX2和pMD2.G)共轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h和72 h收集上清液，通過0.45 μm濾菌器，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?dāng)OVCAR3和SKOV3細(xì)胞密度達(dá)到40%時，將病毒液和培養(yǎng)基等比例混合并添加8 mg/L聚凝胺增強病毒感染力，反復(fù)感染細(xì)胞2次后利用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定敲減RAC1的卵巢癌細(xì)胞株。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡檢測RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞的RAC1和TJP1蛋白表達(dá) 細(xì)胞用RIPA裂解后提取總蛋白，蛋白經(jīng)70 V SDS-PAGE電泳2 h、350 mA轉(zhuǎn)膜90 min和5% BSA封閉1 h后，按1 ∶1 000的比例用封閉液稀釋GAPDH、RAC1、TJP1抗體，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后孵育對應(yīng)的二抗(TBST稀釋，1 ∶10 000)，采用ECL化學(xué)發(fā)光自顯影，利用Image J軟件將目的條帶灰度數(shù)值化，并與內(nèi)參的灰度值作歸一化處理，制作直方圖。

1.2.3 劃痕實驗觀察RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞的遷移能力 將對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)95%時，用Tip頭垂直于6孔板劃痕，PBS輕輕洗滌2次后加入無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，0 h和24 h后在倒置顯微鏡下對劃痕進行拍照。計算公式為：細(xì)胞相對遷移率=[實驗組(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/對照組(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)]×100%。

1.2.4 基質(zhì)膠侵襲實驗觀察RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力 按照3 ∶100的比例混合基質(zhì)膠和DMEM，將100 μL混合液滴入小室中央，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中3 h。下室加入800 μL完全培養(yǎng)基，上室加入200 μL含(4～8)×104個對數(shù)生長期卵巢癌細(xì)胞的DMEM。培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min，PBS洗滌2次。用棉球輕輕拭去小室上層細(xì)胞，結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌2次，吹干后顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 免疫熒光染色觀察RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞TJP1蛋白的分布 將對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞接種于細(xì)胞玻片，細(xì)胞密度達(dá)50%時用4%多聚甲醛固定，PBS洗3次。0.5% Triton-X破膜，PBS洗3次。5% BSA封閉1 h，TJP1抗體孵育過夜。次日，PBS洗滌后孵育熒光二抗1 h，PBS洗3次。DAPI染核5 min，PBS洗3次。取出爬片倒置于滴加抗熒光淬滅劑的載玻片上，透明甲油封片，利用共聚焦熒光顯微成像系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均重復(fù)3次，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。兩組獨立樣本間的比較，如數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布則使用t檢驗，如不服從正態(tài)分布則使用非參數(shù)t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建pLKO.1-puro RAC1 shRNA載體

構(gòu)建的RAC1shRNA載體轉(zhuǎn)化后，隨機挑取6個菌落擴增后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳顯示第1、5和6號樣本酶切產(chǎn)物條帶位置正確(約5 000 bp和2 000 bp)，見圖1A。選取1號樣本測序發(fā)現(xiàn)載體中插入的序列與合成的RAC1shRNA序列一致，見圖1B，說明成功構(gòu)建pLKO.1-puroRAC1shRNA載體。

A：RAC1 shRNA載體酶切電泳圖，M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物，1～6：6個菌落分別對應(yīng)的質(zhì)粒樣本；B：RAC1 shRNA載體中插入序列測序結(jié)果

2.2 慢病毒感染后卵巢癌細(xì)胞中RAC1蛋白表達(dá)下降

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與空載對照組相比，感染RAC1shRNA慢病毒的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞中RAC1蛋白表達(dá)水平明顯下降(t值分別為8.37和8.90，P<0.05)，見圖2。證明RAC1shRNA慢病毒感染的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞成功敲減RAC1基因。

2.3 穩(wěn)定敲減RAC1基因后卵巢癌細(xì)胞遷移能力降低

細(xì)胞劃痕實驗顯示，穩(wěn)定敲減RAC1的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞遷移能力較空載對照組明顯降低(t值分別為40.17和41.76，P<0.01)，見圖3。說明穩(wěn)定敲減RAC1基因能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移能力。

2.4 穩(wěn)定敲減RAC1基因后卵巢癌細(xì)胞侵襲能力下降

基質(zhì)膠侵襲實驗顯示，與空載對照組相比，穩(wěn)定敲減RAC1的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞在24 h內(nèi)穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(t值分別為17.06和8.50，P<0.01)，見圖4。說明穩(wěn)定敲減RAC1基因能抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.5 穩(wěn)定敲減RAC1基因后卵巢癌細(xì)胞中TJP1蛋白的表達(dá)和分布

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，穩(wěn)定敲減RAC1的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞中TJP1蛋白表達(dá)量較空載對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖5。說明RAC1不影響卵巢癌細(xì)胞中TJP1的表達(dá)。

免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，空載對照組OVCAR3和SKOV3細(xì)胞中TJP1蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞間較少。穩(wěn)定敲減RAC1后細(xì)胞形態(tài)明顯變小，TJP1蛋白由胞質(zhì)遷移至胞膜附近，集中在細(xì)胞間接觸處，排列呈致密的毛刺樣，細(xì)胞間連接更加緊密，見圖6。結(jié)果表明，卵巢癌細(xì)胞中穩(wěn)定敲減RAC1并不影響TJP1蛋白的表達(dá)，但可調(diào)節(jié)TJP1蛋白在細(xì)胞中的分布，使細(xì)胞間緊密連接加強。

a：P<0.05，與對照組比較

標(biāo)尺為200 μm；a：P<0.01，與對照組比較

標(biāo)尺為200 μm；a：P<0.01，與對照組比較

3 討論

隨著手術(shù)、放化療、分子靶向藥物和腫瘤免疫治療的不斷發(fā)展，許多腫瘤患者的生存時間都得到了不同程度的延長，但卵巢癌患者5年生存率仍低于40%，主要原因之一是卵巢癌極易在腹腔中播散轉(zhuǎn)移[7]，而惡性腫瘤難以治愈的根本原因就是腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。作為小GTP結(jié)合蛋白的Ras超家族成員，RAC1能調(diào)控細(xì)胞生長、骨架重組和激活蛋白激酶。RAC1可激活WASP家族富含脯氨酸同源蛋白(WAVE)調(diào)控復(fù)合物和蛋白激酶A，加快肌動蛋白聚合和板狀偽足的形成，從而促進細(xì)胞遷移和侵襲[8-9]。Fang等[10]發(fā)現(xiàn)RAC1能激活MEK1/2和Src信號通路使卵巢癌細(xì)胞獲得間質(zhì)表型，促進細(xì)胞的遷移和侵襲特性。RAC1還可通過ROS/MAPK/AP-1和PAK/p38/MMP-2信號軸抑制卵巢癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，促進細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和降解，建立和維持鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白介導(dǎo)的上皮細(xì)胞間黏附[11-12]。本研究結(jié)果表明穩(wěn)定敲減RAC1能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，說明RAC1是參與調(diào)控卵巢癌轉(zhuǎn)移的重要分子。

圖5 蛋白質(zhì)印跡檢測RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞TJP1蛋白表達(dá)

箭頭標(biāo)注為TJP1集中分布的位置，標(biāo)尺為25 μm

TJP1作為調(diào)控細(xì)胞緊密連接的關(guān)鍵因子，具有連接細(xì)胞間屏障和調(diào)節(jié)肌動蛋白的作用。TJP1可以增強細(xì)胞間連接，抑制腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位解離，減少對周圍組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。乳腺癌、結(jié)直腸癌和肝細(xì)胞癌中TJP1表達(dá)下調(diào)，會促進腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[14-16]。因此，TJP1與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲特性密切相關(guān)。此外，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)TJP1與卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲的抑制密切相關(guān)[17]，但其調(diào)控機制尚未闡明，因此我們試圖探討RAC1是否通過TJP1調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲減RAC1的卵巢癌細(xì)胞中TJP1蛋白表達(dá)并未上調(diào)，但是免疫熒光染色顯示TJP1的分布由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜，在細(xì)胞間連接處顯著聚集，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞與細(xì)胞間TJP1表達(dá)相對增加，并伴隨著細(xì)胞間緊密連接加強和細(xì)胞體積縮小，這些變化都會降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。因此，我們推測RAC1可能是通過調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞中TJP1蛋白的分布從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。一些研究報道也佐證了這一結(jié)果，Knezevic等[18]用血小板活化因子刺激HUVEC細(xì)胞后，GTP-RAC1被激活，全細(xì)胞裂解液中TJP1表達(dá)量未發(fā)生改變，但是TJP1在近胞膜處的閉合帶狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂甚至消失。Kleeff等[19]報道TJP1在細(xì)胞膜上的分布與細(xì)胞的遷移和侵襲能力相關(guān)。1-磷酸鞘氨醇可依賴于皮層蛋白(cortactin)將TJP1轉(zhuǎn)運至片狀偽足，調(diào)節(jié)細(xì)胞的趨化、遷移和擴散[6]。這些調(diào)控為TJP1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜提供了可能。

綜上所述，本研究結(jié)果表明卵巢癌細(xì)胞中穩(wěn)定敲減RAC1可能通過影響TJP1蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布，增強細(xì)胞間緊密連接，從而抑制細(xì)胞遷移和侵襲。這為探尋卵巢癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制和尋找抑制轉(zhuǎn)移的分子靶點提供了實驗依據(jù)，但RAC1調(diào)控TJP1分布的具體機制有待于進一步研究。