輝光放電等離子體對(duì)硫色鐮刀菌的殺菌作用

杜明遠(yuǎn)，龍海濤，田立鵬，付國(guó)瑞，畢 陽(yáng)，蒲陸梅,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

鐮刀菌（Fusarium）是農(nóng)作物中一種重要的植物病原真菌[1]。該菌種類繁多、分布范圍廣，通過(guò)寄生或腐生生活，易侵染多種糧食、油料等農(nóng)作物，引起根腐、莖腐和穗（粒）腐等多種病害，這些病害嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)及糧食產(chǎn)量，其中以鐮刀菌引起的馬鈴薯干腐病較為常見[2-3]。據(jù)報(bào)道，中國(guó)每年至少有20%的馬鈴薯因采后病害等原因而爛損，而鐮刀菌引起的馬鈴薯干腐病占貯藏期間真菌性病害的50%以上[4-5]。硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）是引起我國(guó)西北地區(qū)馬鈴薯干腐病的主要病原菌之一，并且致病力最強(qiáng)[6-7]。此外，被硫色鐮刀菌侵染的馬鈴薯塊莖體內(nèi)會(huì)積累大量單端孢霉烯族毒素[8]，其中以T-2毒素的毒性最強(qiáng)[9]，這類毒素不僅降低了馬鈴薯的品質(zhì)，而且還會(huì)通過(guò)不同的毒性機(jī)制對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生毒性，給人和動(dòng)物的食用安全帶來(lái)嚴(yán)重隱患。因此，有效控制和殺滅鐮刀菌在馬鈴薯病害防控領(lǐng)域具有重大意義。

目前，國(guó)內(nèi)外多采用化學(xué)防治、生物防治措施對(duì)馬鈴薯干腐病進(jìn)行預(yù)防和控制[10]。較為常用的化學(xué)殺菌劑能夠有效地控制馬鈴薯干腐病，但是大多數(shù)化學(xué)殺菌劑處理會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，農(nóng)藥殘留問(wèn)題嚴(yán)重，而且還會(huì)使病原體產(chǎn)生抗藥性[11]。生物防治是指通過(guò)對(duì)鐮刀菌具有拮抗作用的菌種（主要有木霉屬真菌、非致病尖孢鐮刀菌和芽孢桿菌）抑制鐮刀菌的生長(zhǎng)，從而控制干腐病的發(fā)生。然而，微生物之間這種生長(zhǎng)抑制作用易受溫度、濕度等各種環(huán)境因素的影響，并且大多數(shù)拮抗菌多為實(shí)驗(yàn)室篩選，在自然環(huán)境下繁殖能力較弱，對(duì)鐮刀菌生長(zhǎng)抑制作用有限，這些因素制約了該技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用[12]。因此，尋找一種能代替化學(xué)和生物殺菌劑且安全高效、不受環(huán)境條件制約、對(duì)環(huán)境無(wú)污染的方法成為關(guān)鍵。

輝光放電等離子體（glow discharge plasma，GDP）作為一種新型的高級(jí)氧化技術(shù)，是一種能夠在水溶液中通過(guò)直流放電產(chǎn)生等離子體的電化學(xué)方法[13-14]。其原理是利用外加直流電場(chǎng)作用，在特定的電化學(xué)反應(yīng)容器內(nèi)，當(dāng)兩極間的電壓（500～600 V）足夠高時(shí)，電極與周圍電解液之間會(huì)持續(xù)產(chǎn)生如·OH、·H、H2O2等多種高活性粒子[15]。研究表明，在輝光放電過(guò)程中，這些活性粒子就是輻射源，能夠影響后續(xù)的反應(yīng)，在電解質(zhì)溶液中參與化學(xué)反應(yīng)并提供活性中間體[16-17]。有大量文獻(xiàn)報(bào)道該方法已成功應(yīng)用于污水處理和有機(jī)染料降解[18-21]。另外，還有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道表明，GDP處理能夠高效去除食物中真菌毒素（棒曲霉素、T-2毒素和立枯絲核菌毒素），并且對(duì)食物的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分影響很小[22-25]；此外，該方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和（常溫、常壓）、環(huán)保無(wú)殘留物等優(yōu)點(diǎn)，但是該技術(shù)在食物中病原真菌殺滅方面鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇硫色鐮刀菌為研究對(duì)象，研究GDP對(duì)硫色鐮刀菌孢子的殺滅效果，同時(shí)從細(xì)胞生物學(xué)角度初步考察對(duì)該菌的殺菌機(jī)理，旨在為GDP技術(shù)應(yīng)用于殺滅食物中鐮刀菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）BNCC 117681由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基自制；馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基的制備參考文獻(xiàn)[26]。

葡萄糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉上海源葉生物科技有限公司；蛋白胨 上海中秦化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD生物潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21 FS1C生物顯微鏡、BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DH1722-6高壓直流電源北京大華無(wú)線電儀器廠。

GDP殺菌設(shè)備（圖1）主要包括反應(yīng)器和高壓直流電源兩個(gè)部分。其中反應(yīng)器由兩根電極組成，陽(yáng)極是由直徑為0.5 mm的鉑絲組成，陰極是由直徑為1.0 cm的碳棒組成。外部設(shè)備冷卻水裝置控制反應(yīng)溫度，磁力攪拌器促使等離子體中活性成分與電解質(zhì)溶液充分反應(yīng)。

圖 1 GDP反應(yīng)系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the GDP experimental apparatus

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

參考潘春青等[27]的方法，將1 mL無(wú)菌水滴加至含硫色鐮刀菌菌株的斜面培養(yǎng)物中，搖勻，吸取200 μL菌懸液滴加至PDA培養(yǎng)基中心位置，用玻璃棒涂布均勻，26 ℃ 恒溫培養(yǎng)5 d后，篩選出生長(zhǎng)良好的菌株，用直徑為6 mm的打孔器在PDA培養(yǎng)基上打取菌餅，用鑷子挑取并接種于新制PDA培養(yǎng)基，26 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，4 ℃ 冰箱保存，備用。

1.3.2 孢子懸浮液的制備

參考胡林剛等[5]的方法，取26 ℃培養(yǎng)7 d的硫色鐮刀菌培養(yǎng)皿1 個(gè)，加入10 mL無(wú)菌水，用玻璃涂布棒刮下平板上的硫色鐮刀菌孢子，經(jīng)雙層紗布過(guò)濾然后轉(zhuǎn)入150 mL錐形瓶中，充分振蕩后，移取10 μL濾液滴加到血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水稀釋至所需濃度為2×106個(gè)/mL。

1.3.3 GDP處理

取50 mL濃度為2.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，將其加入到輝光放電反應(yīng)容器中，通過(guò)調(diào)節(jié)電源電壓從0逐漸增加到650 V，測(cè)定電流強(qiáng)度隨電壓的變化曲線。根據(jù)GDP的特性，確定等離子體產(chǎn)生的條件（電壓及電流強(qiáng)度變化范圍）在確定的電壓及電流強(qiáng)度變化范圍內(nèi)，并在室溫、常壓條件下對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行輝光放電處理。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

選取處理電壓分別為500、520、540、580、600 V，處理時(shí)間分別為3、6、9、12、15、18 min，電極極距分別為1.0、1.5、2.0、2.5 cm，以Na2SO4、NaNO3、NaCl、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液作為電解質(zhì)，研究GDP處理電壓、時(shí)間、極距和電解質(zhì)對(duì)硫色鐮刀菌殺菌率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化GDP對(duì)殺菌效果的影響

參考張志偉[28]的方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案以處理電壓（A）、處理時(shí)間（B）和電極極距（C）作為響應(yīng)變量，以殺菌率（Y）作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表 1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素-水平表Table 1 Code and level of independent variable used for response surface design

1.3.6 殺菌率測(cè)定

通過(guò)硫色鐮刀菌殺菌率分析各因素對(duì)GDP殺菌效果的影響，參考GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》測(cè)定100 μL孢子懸浮液中的孢子存活數(shù)量。殺菌率根據(jù)下式計(jì)算。

式中：N0為GDP處理前硫色鐮刀菌菌落數(shù)/CFU；N為GDP處理后硫色鐮刀菌菌落數(shù)/CFU。

1.3.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取50 mL濃度為2.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液加入到輝光放電反應(yīng)容器中，在優(yōu)化后的最佳GDP工藝條件下處理孢子懸浮液，移取0.5 mL加入到含有4.5 mL無(wú)菌水的玻璃試管后，振蕩混勻，隨后進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇稀釋度為103，將孢子懸浮液涂布于馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，26 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以未經(jīng)GDP處理的孢子懸浮液作為對(duì)照組進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.8 生理活性指標(biāo)測(cè)定

取50 mL濃度為2.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液加入到輝光放電反應(yīng)容器中，在優(yōu)化后的最佳GDP工藝條件下處理孢子懸浮液，測(cè)定以下硫色鐮刀菌孢子指標(biāo)，其中以未經(jīng)GDP處理孢子作為對(duì)照。孢子萌發(fā)率：參考胡林剛等[5]的方法，通過(guò)生物顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)；菌絲生長(zhǎng)量：參考燕璐[29]的方法，通過(guò)十字交叉法測(cè)定菌落直徑和菌體干質(zhì)量；細(xì)胞膜滲透性：參考周靈靈等[30]的方法測(cè)定孢子懸浮液的相對(duì)電導(dǎo)率；孢子孢內(nèi)物質(zhì)釋放量：參考蓋智星等[31]的方法，通過(guò)紫外吸收法測(cè)定孢子孢內(nèi)可溶性蛋白和核酸滲漏量；麥角甾醇質(zhì)量濃度：參考蘆慧[32]的方法通過(guò)紫外吸收法測(cè)定；丙二醛濃度：參考蘆慧[32]的方法采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定；孢子碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色：參考燕璐[29]的方法通過(guò)熒光顯微鏡觀察孢子細(xì)胞膜完整性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 個(gè)平行，用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，用Origin 9.0軟件繪圖，用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，分析顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GDP電流強(qiáng)度-電壓特征曲線

以硫色鐮刀菌孢子懸浮液作為電解液的GDP電流強(qiáng)度-電壓特征曲線如圖2所示，電流強(qiáng)度隨電壓的變化可以分為4 個(gè)階段：在AB段，電壓處于0～150 V，電流強(qiáng)度隨電壓的增加而增加，其變化遵循歐姆定律，屬于普通的電解水的過(guò)程；在BC段，電壓處于150～400 V，電流強(qiáng)度隨電壓的增加而減小，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于隨電壓的增大，在陽(yáng)極尖端的電流熱效應(yīng)導(dǎo)致陽(yáng)極附近電解液有一定程度的汽化現(xiàn)象，產(chǎn)生了絕緣性的氣泡，并且絕緣性氣泡的產(chǎn)生量隨著電壓的增加而增加；在CD段，電壓處于400～520 V，電流強(qiáng)度隨電壓的增加而出現(xiàn)不穩(wěn)定的上下波動(dòng)，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生是隨著電壓進(jìn)一步增大，在陰極發(fā)射出的電子在電場(chǎng)中加速成為高能電子，高能電子與陽(yáng)極尖端氣態(tài)水分子發(fā)生碰撞，激發(fā)氣態(tài)水分子發(fā)生了部分電離所致，并且在該階段陽(yáng)極尖端出現(xiàn)了微弱的淡紫色輝光；在DE段，電壓處于520～650 V，電流強(qiáng)度隨著電壓的增加而增加，陽(yáng)極尖端氣泡與高能電子的碰撞加劇，從而促進(jìn)了氣態(tài)水分子的進(jìn)一步電離，并且電離程度隨著電壓的增加而增大，這一階段也是產(chǎn)生等離子體的主要階段，調(diào)節(jié)電壓至540 V，陽(yáng)極尖端能夠觀察到非常明顯的紫色輝光且比較穩(wěn)定，因此選擇540 V電壓作為殺菌電壓，此時(shí)電流強(qiáng)度變化范圍是40～50 mA。

圖 2 硫色鐮刀菌孢子懸浮液的GDP電流強(qiáng)度-電壓特征曲線Fig. 2 Characteristic curve of current against voltage of F. sulphureum spore suspension

2.2 GDP產(chǎn)生條件對(duì)硫色鐮刀菌孢子的殺菌作用

2.2.1 電壓對(duì)殺菌率的影響

圖 3 電壓對(duì)硫色鐮刀菌孢子殺菌率的影響Fig. 3 Effect of voltage on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由圖3可以看出，控制孢子懸液濃度為2.0×106個(gè)/mL，在處理時(shí)間為9 min、電極極距為2 cm的條件下，隨著電壓從500 V升高到600 V，GDP對(duì)硫色鐮刀菌孢子的殺菌效果逐漸增強(qiáng)，600 V時(shí)殺菌率為95.93%，而在500 V時(shí)殺菌率僅為20.85%，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)電壓較低時(shí)，在陰極發(fā)射的電子在電場(chǎng)中加速獲取的能量較低，從而與陽(yáng)極尖端氣態(tài)水分子發(fā)生碰撞，激發(fā)氣態(tài)水分子發(fā)生電離產(chǎn)生的活性粒子（·OH、·H、H2O2）[15]較少，最終導(dǎo)致了等離子體的殺菌效果很弱[33]。張錚等[34]研究介質(zhì)阻擋放電等離子體對(duì)葡萄球菌殺滅效果中也指出，提高電極間電場(chǎng)強(qiáng)度可以增強(qiáng)殺菌效果，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

2.2.2 處理時(shí)間對(duì)殺菌率的影響

圖 4 處理時(shí)間對(duì)硫色鐮刀菌孢子殺菌率的影響Fig. 4 Effect of treatment time on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由圖4可以看出，控制孢子液濃度2.0×106個(gè)/mL、處理電壓540 V、電極極距2 cm的條件下，GDP對(duì)硫色鐮刀菌孢子的殺滅作用隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)處理18 min后，其殺菌率為85.99%，而處理3 min時(shí)，殺菌率僅為18.21%，這與Misra等[35]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)介質(zhì)阻擋放電激發(fā)產(chǎn)生的等離子體，其殺菌效果隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后趨于平緩基本一致。

2.2.3 電極極距對(duì)殺菌率的影響

圖 5 電極極距對(duì)硫色鐮刀菌孢子殺菌率的影響Fig. 5 Effect of inter-electrode distance on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由圖5可以看出，控制孢子液濃度2.0×106個(gè)/mL、處理電壓540 V、處理時(shí)間9 min的條件下，GDP處理對(duì)硫色鐮刀菌孢子殺滅作用隨著電極極距的增加而減小。當(dāng)電極極距從1.0 cm增加到3.5 cm時(shí)，其殺菌率從55.92%減小到9.53%。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于電極極距的增加引起電極兩端的電場(chǎng)強(qiáng)度減小，導(dǎo)致陰極發(fā)射的電子在電場(chǎng)中加速獲取的能量減少，最終導(dǎo)致電子與氣態(tài)水分子碰撞激發(fā)產(chǎn)生的活性粒子減小，所以殺菌率隨著電極極距的增加而減小。張錚等[34]在研究介質(zhì)阻擋放電等離子體殺菌效果時(shí)指出，電極極距對(duì)殺菌率的影響是通過(guò)改變電極間電場(chǎng)強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)的。

2.2.4 電解質(zhì)對(duì)殺菌率的影響

圖 6 電解質(zhì)對(duì)硫色鐮刀菌孢子殺菌率的影響Fig. 6 Effect of electrolytic solutions on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由圖6可以看出，控制孢子液濃度2.0×106個(gè)/mL、處理電壓540 V、處理時(shí)間9 min、電極極距2 cm的條件下，在4 種不同的電解質(zhì)溶液中，GDP處理對(duì)硫色鐮刀菌孢子也具有明顯的致死作用。其中在NaCl電解質(zhì)溶液中GDP的殺菌率最高，達(dá)90.14%，這是由于NaCl在放電過(guò)程中會(huì)生成HClO，而HClO是一種強(qiáng)氧化性物質(zhì)，具有一定的殺菌作用。夏青[36]在研究NaCl和Na2SO4兩種電解質(zhì)中GDP殺菌效果時(shí)，也得出同樣的結(jié)論。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.3.1 回歸方程及方差分析結(jié)果

將響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表2）經(jīng)Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析擬合，得到電壓、處理時(shí)間和電極極距之間的多元二次回歸方程：Y＝77.09+12.31A+9.76B-4.28C+10.94AB+3.19AC+2.43BC-8.05A2-9.15B2-6.14C2。

表 2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知，回歸模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型的決定系數(shù)R2為0.992 7，校正決定系數(shù)為0.983 2，說(shuō)明該方程擬合較好，能有效反映GDP殺菌效果與電壓、處理時(shí)間和電極極距間的關(guān)系。一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著，因此電壓、處理時(shí)間和電極極距對(duì)殺菌率的影響不是一般的線性關(guān)系。根據(jù)F值可知，各因素對(duì)殺菌率的影響由強(qiáng)到弱依次是A（電壓）＞B（處理時(shí)間）＞C（電極極距）。

表 3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.3.2.1 電壓與處理時(shí)間交互作用對(duì)殺菌率的影響

圖 7 電壓與時(shí)間交互影響殺菌效果的響應(yīng)面（A）和等高線圖（B）Fig. 7 Response surface (A) and contour (B) plots showing the effect of interaction between voltage and time on fungicidal efficiency

由圖7A可知，響應(yīng)面坡度較陡，表明電壓和處理時(shí)間的交互作用顯著。由等高線圖（圖7B）可知，當(dāng)電壓一定時(shí)，殺菌效果隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)；當(dāng)處理時(shí)間一定時(shí)，殺菌效果隨著電壓的增大而逐漸增強(qiáng)。

2.3.2.2 電壓與電極極距交互作用對(duì)殺菌率的影響

圖 8 電壓與電極極距交互影響殺菌效果的響應(yīng)面（A）和等高線圖（B）Fig. 8 Response surface (A) and contour (B) plots showing the effect of interaction between voltage and inter-electrode distance on fungicidal efficiency

由圖8A可知，響應(yīng)曲面彎曲程度較小，說(shuō)明處理電壓與電極極距交互作用不明顯。等高線圖（圖8B）反映了當(dāng)處理電壓一定時(shí)，殺菌率隨著處理極距的增大而減小。

2.3.2.3 處理時(shí)間與電極極距交互作用對(duì)殺菌率的影響

圖 9 處理時(shí)間與電極極距交互影響殺菌效果的響應(yīng)面（A）和等高線圖（B）Fig. 9 Response surface (A) and contour (B) plots showing the effect of interaction between time and inter-electrode distance on fungicidal efficiency

由圖9A可知，響應(yīng)曲面趨于平緩，說(shuō)明時(shí)間與電極極距交互作用不明顯。等高線圖（圖9B）反映了當(dāng)處理時(shí)間一定時(shí)，殺菌率隨著處理電極極距的增加而減??；當(dāng)電極極距一定時(shí)，殺菌率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。

2.3.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)多元二次回歸方程經(jīng)數(shù)學(xué)分析，得到殺菌率的最大值。確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為電壓560 V、時(shí)間15 min、電極極距1.55 cm時(shí)，理論殺菌率可達(dá)92.97%。綜合單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，將最佳殺菌條件調(diào)整為處理電壓560 V、處理時(shí)間15 min、電極極距1.5 cm。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，重復(fù)3 次最優(yōu)條件取平均值，得出硫色鐮刀菌殺菌率為92.73%，與預(yù)測(cè)值相差0.24%，處理前后菌落變化比較見圖10。

圖 10 對(duì)照組（A）和處理組（B）菌落比較圖Fig. 10 Comparison of colonies between control (A) and treatment (B) groups

2.4 GDP對(duì)硫色鐮刀菌孢子生理活性的影響

2.4.1 GDP對(duì)硫色鐮刀菌孢子生長(zhǎng)的影響

表 4 GDP對(duì)硫色鐮刀菌孢子生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of GDP on spore growth of F. sulphureum

表4反映了GDP對(duì)硫色鐮刀菌孢子的生長(zhǎng)抑制作用。在最優(yōu)處理?xiàng)l件下處理后，孢子萌發(fā)率、菌落直徑及菌體干質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05），其分別降低82.01%、37.16 mm、96.30 mg，說(shuō)明GDP對(duì)硫色鐮刀菌生長(zhǎng)活性的抑制作用顯著。

2.4.2 GDP對(duì)硫色鐮刀菌菌體質(zhì)膜完整性及氧化損傷程度的影響

相對(duì)電導(dǎo)率是反映菌體細(xì)胞膜滲透性的重要指標(biāo)之一，相對(duì)電導(dǎo)率越高，說(shuō)明細(xì)胞膜滲透性越大[28]。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組分，對(duì)維持真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和膜的完整性以及膜上一些功能蛋白的正常功能發(fā)揮重大作用，因此通過(guò)麥角甾醇質(zhì)量濃度的變化可以間接反映GDP處理對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響[37]。丙二醛為細(xì)胞膜過(guò)氧化分解的產(chǎn)物，因此可將其含量作為反映細(xì)胞膜過(guò)氧化損傷程度的重要指標(biāo)[32]。PI為非膜滲透性熒光染料，質(zhì)膜完整的細(xì)胞中，PI無(wú)法正常進(jìn)入，因此只有細(xì)胞膜破壞后細(xì)胞才能被染料染色，而正常細(xì)胞不能染色[29]。

圖 11 PI染色檢測(cè)孢子細(xì)胞膜完整性Fig. 11 Detection of cell membrane integrity in spores by propidium iodide staining

由表5可知，經(jīng)GDP處理后，相對(duì)電導(dǎo)率增加了21.21%，說(shuō)明細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性發(fā)生了改變[28]；通過(guò)測(cè)定胞內(nèi)可溶性蛋白和核酸滲漏量，發(fā)現(xiàn)GDP處理后細(xì)胞懸液中兩者質(zhì)量濃度均顯著增大，說(shuō)明細(xì)胞膜已經(jīng)發(fā)生了損傷或是出現(xiàn)了破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物流出[34,38]。GDP處理后細(xì)胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度減小了16.87 μg/mL，而丙二醛濃度增加了0.291 μmol/L，結(jié)合杜亞楠[39]的研究結(jié)果，推斷細(xì)胞膜很可能是等離子體作用的主要位點(diǎn)，并且與細(xì)胞膜上麥角甾醇有密切聯(lián)系；丙二醛濃度的增加證明細(xì)胞膜發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。最后將GDP處理后的孢子進(jìn)行PI染色觀察，結(jié)果如圖11所示，可以看出對(duì)照組孢子活性良好，沒有被PI染色劑染色，而處理組孢子出現(xiàn)了不同程度的熒光染色，染色后熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞膜滲透性，染色越深說(shuō)明細(xì)胞膜滲透性越大[29]。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用的是一種在液相介質(zhì)中產(chǎn)生等離子體的方式——輝光放電電解。首先通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究不同因素（電壓、處理時(shí)間、極距和電解質(zhì)）對(duì)殺菌率的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電壓、處理時(shí)間和極距都是影響GDP殺菌效果的有效因素。增加電壓、延長(zhǎng)處理時(shí)間以及減小電極極距都可以提高殺菌效果。通過(guò)響應(yīng)面分析方法建立的硫色鐮刀菌殺菌率的二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型分析得出各因素對(duì)殺菌率的影響大小依次是：電壓＞處理時(shí)間＞電極極距，在電壓560 V、電極極距1.5 cm、處理時(shí)間15 min的條件下，殺菌率達(dá)到92.73%，此時(shí)輝光放電對(duì)硫色鐮刀菌孢子有很好的殺滅效果。

GDP主要包括高活性粒子（·OH、·H、H2O2）、帶電離子、高能電子以及能產(chǎn)生電子躍遷發(fā)射射線的激發(fā)態(tài)原子和分子等[15]。關(guān)于其殺菌機(jī)理，相關(guān)文獻(xiàn)主要從等離子體物理化學(xué)效應(yīng)和細(xì)胞生物學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行報(bào)道。從等離子體物理化學(xué)方面來(lái)講，殺菌機(jī)理包括高活性粒子（·OH、H2O2）的氧化降解作用[15]；在電場(chǎng)中高能電子和離子對(duì)微生物菌體的蝕刻作用[38,40]以及紫外線的輻射作用，但是目前關(guān)于紫外線的輻射殺菌作用存在爭(zhēng)議[40]。從細(xì)胞生物學(xué)方面，相關(guān)文獻(xiàn)不能有效確定等離子體作用于微生物細(xì)胞的具體位點(diǎn)（細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸以及細(xì)胞器等都有可能是等離子體的作用位點(diǎn)）[41]。

細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的保護(hù)屏障，其穩(wěn)定性是細(xì)胞進(jìn)行正常生理功能的基礎(chǔ)[32]。因此，細(xì)胞膜是維持細(xì)胞活性的重要結(jié)構(gòu)。本研究通過(guò)輝光放電處理孢子，發(fā)現(xiàn)處理前后等離子體對(duì)細(xì)胞膜活性的影響非常顯著。結(jié)果表明，等離子體作用于細(xì)胞膜，膜上發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化，膜的組成成分麥角甾醇質(zhì)量濃度顯著減小，膜的滲透性增大，孢內(nèi)大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸跨膜滲漏到胞外。另外，有大量文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于化學(xué)抗菌劑對(duì)植物病原真菌的抑菌機(jī)理，認(rèn)為細(xì)胞膜是化學(xué)抗菌劑作用于植物病原真菌的主要靶點(diǎn)，且與細(xì)胞膜上麥角甾醇有密切聯(lián)系，通過(guò)影響細(xì)胞膜的滲透性而影響胞內(nèi)正常的生理生化反應(yīng)，從而達(dá)到抑菌的效果[5,29,31-32,39]。這與等離子體對(duì)細(xì)胞膜活性的影響結(jié)果也相一致。至于是等離子體中何種成分在起作用，以及采用什么作用機(jī)制（氧化作用、蝕刻作用、紫外輻射作用），還需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明。

另外，還有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了有機(jī)酸、多酚類有機(jī)物，如水楊酸、茶多酚等對(duì)硫色鐮刀菌產(chǎn)毒能力的影響，結(jié)果表明這兩種有機(jī)物對(duì)硫色鐮刀菌產(chǎn)毒能力的影響均表現(xiàn)出了顯著的濃度效應(yīng)[42-43]。但是關(guān)于GDP技術(shù)對(duì)硫色鐮刀菌產(chǎn)毒能力的影響，目前還鮮見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，這將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究。