槲皮素對17α-乙炔雌二醇誘導(dǎo)膽汁淤積的肝保護作用研究

涂君雪 黃婉然 何儲君 鄭毅

膽汁淤積是由各種內(nèi)外原因引起的膽汁排泄障礙，膽汁酸累積于肝臟，導(dǎo)致肝損傷，進一步可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝癌，甚至肝功能衰竭[1]。雌激素及其類似物體內(nèi)水平過高易引起妊娠期婦女，口服避孕藥和接受雌激素替代療法婦女的肝內(nèi)膽汁淤積[2]。目前膽汁淤積治療藥物缺乏，熊去氧膽酸是FDA批準的唯一用于膽汁淤積治療的一線藥物，但約40%的患者對其應(yīng)答不佳，晚期膽汁淤積患者只能通過肝移植延續(xù)生命，因而迫切需要尋求新的有效治療藥物[3]。槲皮素（quercetin，Que）為五羥基黃酮類化合物，不溶于冷水，難溶于熱水，可溶于堿性溶液[4]，廣泛分布于茶葉、蘋果、洋蔥等植物性食物中[5]。既往研究已證實Que具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗血小板聚集、肝細胞保護等多種藥理作用[6]。且有研究表明Que可通過抑制肝星狀細胞活化來預(yù)防肝纖維化，對膽管結(jié)扎和四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和纖維化具有良好的保護作用[7]，然而Que對雌激素誘導(dǎo)膽汁淤積的作用尚不清楚。本實驗采用17α-乙炔雌二醇（17α-ethynylestradiol，EE）誘導(dǎo)建立膽汁淤積模型，探討Que對EE誘導(dǎo)膽汁淤積的肝保護作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級8周雄性SD大鼠32只，重量（240±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。所有動物飼養(yǎng)于標準實驗條件，溫度控制在25℃，晝夜交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試劑與儀器 Que（≥95%，美國sigma公司，Q4951）；EE（美國Sigma公司，E4876）；羧甲基纖維素鈉（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；Trizol試劑（美國Thermo Fisher公司，180608）；ALT測試盒（20180701），AST測試盒（20180611），ALP測試盒（20180415），膽汁酸測試盒（20180709）均購自南京建成生物工程研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量試劑盒（日本Takara公司，R037A）；熒光定量PCR儀（7500 Applied Biosystems，美國Thermo Fisher公司）；倒置顯微鏡（IX71，日本 Olympus公司）；低溫高速離心機（Sorvall ST8R，美國Thermo Fisher公司）；多功能酶標儀（ELX800，美國 BioTek公司）；核酸測定儀（Nanodrop 2000c，美國Thermo Fisher公司）。

1.3 實驗分組 按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、模型組、給藥組（Que 50 mg/kg組和Que 100 mg/kg組），每組8只。模型組及給藥組連續(xù)5 d皮下注射5 mg/kg EE溶液（溶于丙二醇，注射體積為0.1 ml/100 g）造模，造模成功20只，其中模型組6只，Que 50 mg/kg組和Que 100 mg/kg組各7只；對照組皮下注射EE溶劑丙二醇（注射體積為0.1 ml/100g）。對照組及模型組予Que溶劑0.5%羧甲基纖維素鈉溶液（灌胃體積為1 ml/0.1 kg）灌胃，Que 50 mg/kg組和Que 100 mg/kg組分別予50和100 mg/kg Que（溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，灌胃體積為1 ml/0.1 kg）灌胃。1次/d，連續(xù)4周，最后一次給藥后禁食過夜。

1.4 大鼠膽汁流量測定 大鼠膽管插管收集膽汁。采用2%戊巴比妥（0.15 ml/100 g）麻醉大鼠，將大鼠以仰臥位固定在大鼠板上；剔除毛發(fā)，乙醇消毒，從劍突下1 cm處用手術(shù)剪剪開小口，確認十二指腸位置，翻轉(zhuǎn)十二指腸找到淡黃色的膽管，輕輕分離周圍的腸系膜；膽管下方穿一根手術(shù)線，用眼科剪順著膽管方向剪一個小口，插入PE導(dǎo)管，用手術(shù)線結(jié)扎固定，收集1 h內(nèi)的膽汁酸，將膽汁的密度按1 g/ml計算，按照[（樣品管重量-空管重量）×1 g/ml]/（時間×體重）計算膽汁流量。

1.5 血清生化指標測定 眼眶取血收集血清，嚴格按照生化試劑盒說明書的操作流程測定大鼠血清中ALP、AST、ALT水平，評價肝臟的損傷程度及Que的藥理作用。

1.6 HE染色 將大鼠處死并液氮速凍收集肝臟組織，保存于-80℃?zhèn)溆?。組織用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片，二甲苯脫鈉，HE染色，常規(guī)脫水，封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。

1.7 膽汁酸測定 取100 mg左右的肝臟組織置于玻璃勻漿器中，加入9倍體積的冰PBS溶液，充分勻漿，隨后以3 000 g 4℃離心10 min，取上清液即為制備的肝組織勻漿液。取血清或肝組織勻漿液，按照膽汁酸測定試劑盒說明檢測血清與肝臟中膽汁酸水平。

1.8 肝組織膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運體、外排轉(zhuǎn)運體、膽汁酸合成酶及代謝酶mRNA表達測定 采用RT-qPCR法測定膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運體[鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）和有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（organic anion transporting polypeptide,OATP）1A2 和 OATP1B1]、外排轉(zhuǎn)運體[膽汁酸鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）2、MRP3和 MRP4]、膽汁酸合成酶[細胞色素 P450酶（cytochrome P450，CYP）7A1、CYP8B1 和 CYP27A1]及代謝酶[CYP3A2、CYP2B10、硫酸基轉(zhuǎn)移酶（sulfotransferase，SULT）2A1和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyl transferases,UGT）1A1]的mRNA表達情況。將40 mg左右的肝臟組織置于玻璃勻漿器中，加入500 μl Trizol試劑，冰上研磨，移取液體至EP管中，加入200 μl氯仿，用手上下劇烈震蕩15 s，放置15 min。隨后在冷凍離心機中12 000 g 4℃離心15 min。取上清液，加入等量的異丙醇，震搖混勻后，靜置10 min，12 000 g 4℃離心10 min，倒去液體，加入75%乙醇溶液，渦旋洗滌沉淀，8 000 g 4℃離心5 min，盡量吸干乙醇溶液，晾干，沉淀未完全干燥時加入60 μl PCR水。使用核酸測定儀測定RNA純度及濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用熒光定量試劑盒，采用兩步法PCR程序擴增，記錄數(shù)據(jù)，以β-actin為內(nèi)參計算相對表達。引物序列見表1。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphpad 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟組織學(xué)損傷比較 肝臟組織學(xué)檢查表明，對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常，而EE誘導(dǎo)了肝毒性。給予大鼠EE后可見肝臟大量炎性細胞浸潤，肝細胞水腫，肝組織大面積壞死。給予50 mg/kg Que可見明顯減少的炎癥浸潤，壞死面積減小，水腫緩解。而給予100 mg/kg Que的大鼠炎性細胞浸潤、水腫和壞死顯著改善，已接近對照組大鼠水平，見圖1。

2.2 各組大鼠血清生化指標比較 模型組大鼠血清AST、ALT和ALP水平均明顯高于對照組（均P＜0.01）；AST僅在給予100 mg/kg Que后較模型組降低（P＜0.01），而給予50和100 mg/kg Que后可呈劑量依賴性降低ALT、ALP 水平（均 P＜0.05），且 Que 100 mg/kg組已恢復(fù)至對照組大鼠水平，見圖2。

2.3 各組大鼠膽汁流量和膽汁酸水平比較 EE誘導(dǎo)的膽汁淤積可明顯減少大鼠的膽汁流量（P＜0.01），給予50和100 mg/kg Que可呈劑量依賴性增加大鼠膽汁流量（均P＜0.01）。EE處理大鼠血清及肝臟的膽汁酸水平均升高（均P＜0.01），而給予100 mg/kg Que后，可明顯降低血清及肝臟的膽汁酸水平（均P＜0.05），見圖3。

表1 RT-qPCR引物序列

圖 1 肝臟組織學(xué)檢查所見（a：對照組；b：模型組；c：Que 50 mg/kg組；d：Que 100 mg/kg組；Que為槲皮素；HE 染色，×200）

2.4 各組大鼠肝臟膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運體的表達比較 EE誘導(dǎo)膽汁淤積大鼠NTCP、OATP1A2、OATP1B1表達水平降低（P＜0.05），給予100 mg/kg Que后可見NTCP表達相比于模型組顯著降低（P＜0.05），而Que對OATP1A2、OATP1B1的表達無明顯影響，見圖4。

2.5 各組大鼠肝臟膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體的表達比較 EE誘導(dǎo)的膽汁淤積可顯著降低肝臟BSEP及MRP2的表達（均P＜0.05），而給予100 mg/kg Que后可增高MRP2表達（P＜0.05），而給予Que后可呈劑量依賴性增高BSEP表達（均P＜0.05）。EE誘導(dǎo)的膽汁淤積可適應(yīng)性上調(diào)MRP3、MRP4表達，100 mg/kg Que可增高 MRP3的表達（均P＜0.05），而50和 100 mg/kg Que均可增高MRP4的表達（均P＜0.05），見圖5。

2.6 各組大鼠肝臟膽汁酸合成酶的表達比較 EE可明顯降低 CYP7A1、CYP8B1和 CYP27A1的表達（均P＜0.05），給予50和100 mg/kg的Que后可進一步降低CYP7A1的表達（均P＜0.05），給予100 mg/kg的Que后可降低CYP8BI的表達（P＜0.05），而 Que對 CYP27A1的表達無明顯影響，見圖6。

圖2 各組大鼠血清生化指標比較（a：各組大鼠血清AST水平比較；b：各組大鼠血清ALT水平比較；c：各組大鼠血清ALP水平比較；Que為槲皮素；與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

圖3 各組大鼠膽汁流量、血清和肝臟膽汁酸水平比較（a：各組大鼠膽汁流量比較；b：各組大鼠血清膽汁酸水平比較；c：各組大鼠肝臟膽汁酸水平比較；Que為槲皮素；與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

圖4 各組大鼠肝臟膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運體的表達比較[a：各組大鼠鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白（NTCP）表達比較；b：各組大鼠有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（OATP）1A2表達比較；c：各組大鼠OATP1B1表達比較；Que為槲皮素；與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05]

圖5 各組大鼠肝臟膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體的表達比較[a：各組大鼠膽汁酸鹽輸出泵（BSEP）表達比較；b：各組大鼠多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）2表達比較；c：各組大鼠MRP3表達比較；d：各組大鼠MRP3表達比較；Que為槲皮素；與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01]

圖6 各組大鼠肝臟膽汁酸合成酶的表達比較[a：各組大鼠細胞色素P450酶（CYP）7A1表達比較；b：各組大鼠CYP8B1表達比較；c：各組大鼠 CYP27A1 表達比較；Que 為槲皮素；與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01]

2.7 各組大鼠肝臟膽汁酸代謝酶的表達比較 EE可明顯降低CYP3A2和CYP2B10的表達（均P＜0.01），而給予100 mg/kg Que后CYP3A2的表達增加（P＜0.01），Que可劑量依賴性增加CYP2B10的表達（均P＜0.05）。同樣EE可明顯降低SULT2A1和UGT1A1的表達（均P＜0.05），給予Que可顯著增加SULT2A1的表達（均P＜0.05），而Que對UGT1A1的表達無明顯影響，見圖7。

3 討論

Que是一種天然黃酮類化合物，已被證實具有多重生物活性和保肝作用[6]，而是否對雌激素誘導(dǎo)的膽汁淤積發(fā)揮作用尚不清楚。本實驗結(jié)果表明Que對雌激素誘導(dǎo)的膽汁淤積具有較好的肝保護作用，可明顯緩解肝臟組織學(xué)變化，降低血清AST、ALT、ALP水平，增加膽汁流量，顯著降低肝臟和血清膽汁酸水平，緩解毒性膽汁酸累積。

膽汁酸轉(zhuǎn)運體在維持膽汁酸平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8]。肝臟膽汁酸轉(zhuǎn)運體主要分為攝取轉(zhuǎn)運體與外排轉(zhuǎn)運體，攝取轉(zhuǎn)運體主要位于肝細胞血竇側(cè)，而外排轉(zhuǎn)運體在血竇側(cè)與膽管側(cè)均有分布[9]。NTCP和OATP家族是位于肝細胞血竇側(cè)的主要攝取轉(zhuǎn)運體，負責(zé)從血液循環(huán)中攝取膽汁酸進入肝細胞[10]。NTCP主要負責(zé)攝取大部分的結(jié)合型膽汁酸，而OATP家族主要擔(dān)任非結(jié)合型膽汁酸的攝取[11]。本實驗結(jié)果表明，EE可明顯抑制NTCP、OATP1A2、OATP1B1的表達，從而適應(yīng)性降低膽汁酸的攝取，膽汁淤積大鼠給予Que后可進一步降低NTCP的表達，從而抑制膽汁酸的重吸收，而對OATP1A2、OATP1B1的表達無明顯影響。

圖7 各組大鼠肝臟膽汁酸代謝酶的表達比較[a：各組大鼠細胞色素P450酶（CYP）3A2表達比較；b：各組大鼠CYP2B10表達比較；c：各組大鼠硫酸基轉(zhuǎn)移酶（SULT）2A1表達比較；d：各組大鼠尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）1A1表達比較；Que為槲皮素；與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01]

BSEP和MRP2是位于肝細胞膽管側(cè)的主要外排轉(zhuǎn)運體，負責(zé)將肝臟中膽汁酸外排到膽汁中[8]。BSEP底物較廣，包括非結(jié)合型膽汁酸及?；撬帷⒏拾彼岷土蛩峤Y(jié)合型膽汁酸，對牛磺結(jié)合型膽汁酸具有較高的親和力[11]。MRP2可轉(zhuǎn)運二價膽汁酸如硫酸化?；悄懰岷透拾蹦懰幔荒苻D(zhuǎn)運一價膽汁酸。BSEP和MRP2的功能正常是維持膽汁酸腸肝循環(huán)的重要環(huán)節(jié)[12]。EE可明顯降低BSEP與MRP2的表達，而給予Que后顯著增加兩者的表達。MRP3和MRP4是位于肝細胞血竇側(cè)的外排轉(zhuǎn)運體，在正常生理情況下表達較低，而在膽汁淤積患者中的表達水平增加，主要參與結(jié)合型膽汁酸外排至血液循環(huán)。本實驗結(jié)果表明EE誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠肝臟MRP3和MRP4的表達略有增加，而給予Que后，可明顯增高MRP3和MRP4的表達水平，因而Que通過促進膽管側(cè)與血竇側(cè)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體的表達從而促進肝內(nèi)膽汁酸的外排。

膽汁酸在肝臟由膽固醇經(jīng)CYP7A1和CYP8B1介導(dǎo)的經(jīng)典途徑及CYP27A1介導(dǎo)的替代途徑合成[13]。經(jīng)典途徑合成人體約90%的膽汁酸，主要合成初級的膽酸及鵝去氧膽酸[14]。CYP7A1是細胞色素P450家族的一員，為膽汁酸合成的關(guān)鍵限速酶，而CYP8B1則是合成膽酸過程所必須的酶[15]。CYP27A1介導(dǎo)的替代途徑主要合成鵝去氧膽酸[16]。本實驗中，EE可明顯降低CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1的表達，可能為機體適應(yīng)性調(diào)節(jié)而降低膽汁酸的合成，而給予Que后可一步抑制經(jīng)典途徑CYP7A1和CYP8B1的表達，而對替代途徑的CYP27A1無明顯影響，從而進一步抑制膽汁酸的合成。

膽汁酸代謝由Ⅰ相代謝與Ⅱ相代謝組成[14]。CYP3A2和CYP2B10是介導(dǎo)膽汁酸Ⅰ相代謝的關(guān)鍵酶，負責(zé)將膽汁酸生物轉(zhuǎn)化成高親水性和非毒性膽汁酸（如鼠膽酸）[17]。Ⅱ相代謝為膽汁酸結(jié)合反應(yīng)，在膽汁酸合成之后，大部分膽汁酸可快速與氨基酸（甘氨酸和?；撬幔┙Y(jié)合，也可經(jīng)硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT2A1催化與硫酸基結(jié)合，或經(jīng)UGT1A1作用進行葡萄糖醛酸化[18]。EE可明顯降低 CYP3A2、CYP2B10、SULT2A1 和 UGT1A1的表達，而給予Que后，可明顯降低CYP3A2、CYP2B10、SULT2A1，而對UGT1A1的表達無明顯影響。由此可知，Que可通過抑制膽汁酸的合成，促進膽汁酸的代謝而減輕肝臟膽汁淤積。

綜上所述，Que對EE誘導(dǎo)的膽汁淤積肝損傷具有明顯的保護作用，機制與其抑制攝取轉(zhuǎn)運體NTCP和合成酶CYP7A1與CYP8B1的表達而降低肝臟膽汁酸重吸收和合成，促進外排轉(zhuǎn)運體BSEP、MRP2、MRP3、MRP4與代謝酶 CYP3A2、CYP2B10、SULT2A1的表達從而促進膽汁酸的外排和代謝密切相關(guān)。Que具有被開發(fā)成為新型治療膽汁淤積藥物的前景。