不同蛋白酶對豆粕抗原蛋白降解程度的比較分析

張忠鑫 鄒球龍 黎 琪 張曉琳 仉 磊*

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京102209；2.北京市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全源頭控制工程技術(shù)研究中心，北京102209）

豆粕作為優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白質(zhì)，是目前飼料工業(yè)應(yīng)用最廣泛的原料之一。豆粕的氨基酸組成較為合理，可滿足動物營養(yǎng)需要，但存在抗?fàn)I養(yǎng)因子種類多、含量高的缺陷，使得其作為動物飼料的消化利用率偏低，造成浪費的同時也引起腹瀉等諸多的動物疾病[1-4]。其中大豆球蛋白（Glycinin）和β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）這兩種抗原蛋白致敏性最強(qiáng)，占大豆總蛋白的65%以上[4]。因此，如何降低飼料的抗原蛋白從而提升豆粕利用價值是飼料企業(yè)和養(yǎng)殖者亟需解決的問題。

抗原蛋白可以通過微生物發(fā)酵及利用蛋白酶酶解進(jìn)行消除。實際生產(chǎn)中往往兩者同時進(jìn)行[5-12]。蛋白酶制劑主要根據(jù)其最適pH值分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶[13]。盡管豆粕的pH值在6.4～6.8的近中性范圍，但在微生物發(fā)酵過程中發(fā)酵豆粕的pH值逐漸降至4.5～5之間。另外在微生物發(fā)酵過程中的體系溫度也與酶制劑的最適溫度有差異。因此，選用適于微生物發(fā)酵條件的酸性蛋白酶及中性蛋白酶，并調(diào)節(jié)二者的劑量比例對提升發(fā)酵豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效率十分重要。本研究通過調(diào)研部分市售蛋白酶產(chǎn)品，檢測其在微生物發(fā)酵條件下對豆粕抗原蛋白的降解能力，為工業(yè)生產(chǎn)過程中挑選適合的發(fā)酵劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

46%豆粕購自三河匯福糧油集團(tuán)飼料蛋白有限公司；MRS 培養(yǎng)基及LB 培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；大豆球蛋白定量測定試劑盒購自北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，植物乳桿菌GJ25 及枯草芽孢桿菌BS01均為實驗室保藏菌株。

通過市場調(diào)研，分別采購12 種市售酸性及中性蛋白酶，廠家信息略。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢測酸性蛋白酶降解豆粕抗原蛋白

根據(jù)市售發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的實際情況，在利用酸性蛋白酶降解抗原蛋白時，體系中添加2%的乳酸。即分別在200 ml 無菌水中加入稱取的0.2 g 酶制劑（50 000 U/g）及2 g 乳酸，混勻后加入到100 g 豆粕中，攪拌均勻后置于37 ℃恒溫24 h，酶解完成后按王寅等[14]報道的方法提取蛋白質(zhì)，選用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量變化[14-16]。

1.2.2 檢測中性蛋白酶降解豆粕抗原蛋白

由于豆粕的pH值為6.5左右，因此無額外條件更改。即分別在200 ml無菌水中加入稱取的0.2 g酶制劑（50 000 U/g），混勻后加入到100 g 豆粕中，攪拌均勻后置于37 ℃恒溫24 h，發(fā)酵完成后提取蛋白質(zhì)[14]，選用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量變化[14-16]。

1.2.3 蛋白酶解與微生物發(fā)酵同時進(jìn)行的情況分析

接種GJ25乳酸菌種子于MRS 培養(yǎng)基，37 ℃過夜靜置培養(yǎng)，使其活菌數(shù)達(dá)到1×109CFU/ml 以上；接種BS01枯草芽孢桿菌種子于LB培養(yǎng)基，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，使其活菌數(shù)達(dá)到1×106CFU/ml以上。以上兩類菌液各取1 ml 加入到200 ml 無菌水中，按試驗比例（酸性蛋白酶與中性蛋白酶的比例為10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10）稱取不同質(zhì)量的兩類蛋白酶并接入水中，保證兩種蛋白酶酶活總值為50 000 U/g，稱取混合酶制劑的質(zhì)量為0.4 g。充分混合后加入到100 g豆粕中，攪拌均勻后置于37 ℃恒溫48 h，發(fā)酵完成后提取蛋白質(zhì)[14]，選用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量變化[14-16]，從而選出最優(yōu)酶制劑比例。

1.2.4 發(fā)酵時間的確定

按照所選擇的酶制劑比例重復(fù)進(jìn)行1.2.3節(jié)的試驗，并在0、1、3、16、24、48、72 h取樣并提取蛋白質(zhì)[14]，進(jìn)行電泳檢測并利用膠圖分析軟件UVP-VisionWorks對電泳結(jié)果中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的條帶進(jìn)行定量分析：將未經(jīng)處理的豆粕對照樣品中的對應(yīng)條帶設(shè)定為100%，計算其他各試驗組相關(guān)條帶的相對含量，從而挑選出最合適的發(fā)酵時長。

1.2.5 乳酸含量測定

取10 g 樣品，加入100 ml 煮沸過的去離子水，振蕩溶解10～20 min，取樣離心取上清，利用生物傳感分析儀（型號SBA-40E，山東省科學(xué)院生物研究所）測定乳酸含量并換算樣品中乳酸含量。

1.2.6 大豆球蛋白含量測定

利用大豆球蛋白定量測定試劑盒（北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司）進(jìn)行測定。

1.2.7 粗蛋白含量測定依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗蛋白的測定，凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018）進(jìn)行測定。

1.2.8 酸溶蛋白含量測定

按照常磊等[11]報道的方法進(jìn)行測定。

2 試驗結(jié)果

2.1 不同酸性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白降解效果的比較

利用不同酸性蛋白酶對豆粕進(jìn)行處理，通過對其產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳檢測各酸性蛋白酶對豆粕中兩類抗原蛋白的降解效果，結(jié)果如圖1所示，在實驗設(shè)定條件下(試驗方法1.2.1)，各酸性蛋白酶酶制劑對豆粕的抗原蛋白降解程度具有差異，5號酸性蛋白酶在此條件下對抗原蛋白降解效率較高，其工作濃度為0.2%(m/m)。

圖1 不同酸性蛋白酶制劑對豆粕抗原蛋白的降解效果

2.2 不同中性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白降解效果的比較

利用不同中性蛋白酶對豆粕進(jìn)行處理，通過對其產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳檢測各中性蛋白酶對豆粕中兩類抗原蛋白的降解效果，結(jié)果如圖2所示，在實驗設(shè)定條件下(試驗方法1.2.2)，各中性蛋白酶酶制劑對豆粕的抗原蛋白降解程度具有差異，5號中性蛋白酶在此條件下對抗原蛋白降解效率較高，其工作濃度為0.2%(m/m)。

2.3 不同蛋白酶配比劑量對豆粕抗原蛋白降解程度的比較

將上文挑選出的兩種蛋白酶按照如圖3 所示的質(zhì)量比例進(jìn)行混合，在微生物存在條件下（試驗方法1.2.3，GJ25 及BS01 在達(dá)到菌液濃度要求后,每100 g豆粕添加1 ml菌液）發(fā)酵48 h后提取蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖3。

圖2 不同中性蛋白酶制劑對豆粕抗原蛋白的降解效果

圖3 兩類蛋白酶不同比例條件下的菌酶協(xié)同效果

通過膠圖分析軟件UVP-VisionWorks對圖3(a)中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的條帶進(jìn)行定量分析，并將未經(jīng)處理的豆粕對照樣品中的對應(yīng)條帶設(shè)定為100%，計算其他各試驗組相關(guān)條帶的相對含量，得到圖3(b)的結(jié)果。結(jié)果顯示，酸性蛋白酶與中性蛋白酶的混合作用可降解豆粕中大于60%的兩類抗?fàn)I養(yǎng)因子。其中，酸性蛋白酶與中性蛋白酶的比例在1∶1至1∶5內(nèi)降解效果達(dá)到最優(yōu)，最終確定比例為1∶1時較為合理，兩者工作濃度均為0.2%。

2.4 發(fā)酵時間的確定

利用5 號酸性蛋白酶與5 號中性蛋白酶1∶1 配比的酶制劑，在微生物存在條件下（試驗方法1.2.4）對豆粕進(jìn)行處理，在72 h內(nèi)不同時間點采集樣品并進(jìn)行對應(yīng)的電泳檢測，結(jié)果如圖4。

圖4 發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵效果的影響

圖4可見，豆粕中兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解效果隨時間增長而提高，在48 h時達(dá)到最高，與72 h發(fā)酵效果無明顯差異，因此選定利用上文所述兩種酶制劑1∶1配比的菌酶協(xié)同發(fā)酵時間為48 h。

2.5 發(fā)酵效果評價

依據(jù)上述結(jié)果，參考本試驗所用條件（試驗方法1.2.3 及1.2.4）最終確定了發(fā)酵條件為：5 號酸性蛋白酶0.2%，5號中性蛋白酶0.2%，1%（v/m）枯草芽孢桿菌BS01（菌液濃度為1×106CFU/ml），1%（v/m）植物乳桿菌GJ25（菌液濃度為1×109CFU/ml），發(fā)酵時間48 h。對在該條件下得到的發(fā)酵豆粕進(jìn)行部分指標(biāo)測定，結(jié)果如表1所示。

表1結(jié)果表明，本文確定的發(fā)酵劑及發(fā)酵條件下，發(fā)酵豆粕的粗蛋白及其中酸溶蛋白含量較高，提示其營養(yǎng)價值高。大豆球蛋白含量較低，提示該產(chǎn)品對豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效果較好。產(chǎn)品pH值較低，乳酸含量較高可幫助維持動物腸道環(huán)境。另外，該產(chǎn)品還對水蘇糖和棉籽糖兩類抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效果明顯。

表1 豆粕發(fā)酵前后指標(biāo)檢測（以干物質(zhì)88%計）

3 討論

發(fā)酵豆粕是解決豆粕在動物飼喂過程中消化利用率低下的重要手段之一，生產(chǎn)發(fā)酵豆粕需要根據(jù)原料特點選擇適合的條件及發(fā)酵劑。目前發(fā)酵豆粕生產(chǎn)所采用的發(fā)酵劑包含酶制劑和微生物。其中針對蛋白質(zhì)降解起主要作用的是蛋白酶制劑[9-10]。目前市場上酶制劑種類繁多，但是大部分酶制劑的最適條件與實際生產(chǎn)條件存在差異。在對酶制劑進(jìn)行選擇的時候不能僅憑酶活力大小作為判斷依據(jù)，而應(yīng)重點關(guān)注針對目標(biāo)底物的特異性效果。

本試驗針對降解豆粕中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白這一目的，從挑選在非最適條件下適于降解豆粕的酶制劑入手，通過調(diào)整菌劑及酶制劑的配比，實現(xiàn)了較小成本下生產(chǎn)具有較高品質(zhì)的發(fā)酵豆粕。依據(jù)蛋白酶制劑的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 23527—2009），固體蛋白酶產(chǎn)品的活力單位定義為：1 g固體酶粉，在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸，即為一個酶活力單位，以U/g 表示[13]。在發(fā)酵豆粕生產(chǎn)過程中，為保證益生菌的增殖及活性，其發(fā)酵過程中的溫度變化及pH 值變化很難保證蛋白酶處在其最適條件。因此酶制劑產(chǎn)品所標(biāo)示的酶制劑活力并不能反映出其對不同底物如豆粕中大豆蛋白的降解程度。本研究結(jié)果表明，不同來源的酶制劑在酪蛋白水解能力一致的條件下，針對特定原料豆粕的降解效果存在差異。同時中性蛋白酶對豆粕的降解起到更主要的作用，這一結(jié)果也同前人研究結(jié)果一致，綜合考慮成本因素和豆粕降解效果，本研究最終確定了上述酶制劑配比比例及發(fā)酵條件。需要說明的是，由于是隨機(jī)盲選，酸性蛋白酶和中性蛋白酶的最優(yōu)組編號均為5號，但是兩者并不來自同一廠家。另外，本試驗所用豆粕均為自然顆粒大小，沒有經(jīng)過粉碎處理，也沒有滅菌處理，這些條件也是考慮到目前大部分發(fā)酵豆粕生產(chǎn)廠家的實際情況，盡量簡化發(fā)酵的條件控制，具體發(fā)酵條件在實際生產(chǎn)中也可根據(jù)實際情況進(jìn)行微調(diào)。同時，本研究針對特定原料進(jìn)行酶制劑篩選的思路和方法，也為實際生產(chǎn)中如何選擇合適的發(fā)酵劑產(chǎn)品提供了新的參考方案。

4 結(jié)論

本研究通過對酶制劑及酶制劑配比進(jìn)行篩選，確定了菌酶協(xié)同發(fā)酵中一套最適的發(fā)酵條件，適合發(fā)酵豆粕生產(chǎn)。得到的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品中，粗蛋白含量50.86%，酸溶蛋白14.76%，大豆球蛋白25.3 mg/g，pH 值4.5，乳酸含量2.76%，水蘇糖含量0.017%，棉籽糖含量0.082%。該產(chǎn)品抗?fàn)I養(yǎng)因子低、乳酸含量高，是有益動物腸道健康的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品，并能較大程度節(jié)約成本。