植物乳桿菌M1-NTG300產(chǎn)細菌素培養(yǎng)條件優(yōu)化

安 宇 王 穎,2WG ,2 易華西 - 張東杰ZHG -

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2. 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；3. 中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266000)

細菌素是某些細菌代謝時，經(jīng)核糖體合成機制產(chǎn)生的多肽或前體多肽，抑菌活性較突出[1-2]。對同種近緣菌株呈狹窄活性抑制譜，常附著于敏感細胞特異性結合位點，通過抑制細胞生長代謝所必需的組分合成，致使敏感細胞死亡，從而起到抑菌效果[3-4]?，F(xiàn)階段，以乳酸鏈球菌素(Nisin)為代表天然防腐劑克服了生產(chǎn)上的諸多不足，以易消化和降解，使用無蓄積性毒害作用、零殘留、遺傳穩(wěn)定性良好等特點，逐步成為研究者和消費者的關注熱點[5-6]。

在微生物發(fā)酵工藝中，菌種的培養(yǎng)基組分是影響其菌種生長代謝和增殖的決定性因素[7-8]。對發(fā)酵條件的控制直接有利于開發(fā)菌株的發(fā)酵潛力，因此確定合適培養(yǎng)基配比和適合菌種生長增殖的發(fā)酵條件就顯得重要[9]。除受菌株自身遺傳學特質影響外，細菌素產(chǎn)量不僅對生長環(huán)境有限制和要求，某些類細菌素還需外圍干預和誘導才能更好地分泌和蓄積[10]。其中生長環(huán)境多從培養(yǎng)基中氮源和碳源等功能成分的比例，或培養(yǎng)環(huán)境中各條件因素的均衡或特定配比考究，來完成目標物質的產(chǎn)生和釋放。目前對菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究，主要集中在對培養(yǎng)環(huán)境(培養(yǎng)溫度、時間、pH等)的優(yōu)化[11-13]，以及對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分中單一成分來源的優(yōu)化研究[14-15]，而對培養(yǎng)基中多種營養(yǎng)成分的最優(yōu)篩選及與刺激因子協(xié)同作用效果的研究仍較少報道。研究以課題組前期通過復合誘變法(微波—常壓室溫等離子體—亞硝基胍誘變)獲得的在仍保持降膽固醇能力的基礎上，可產(chǎn)細菌素的植物乳桿菌M1-NTG300為研究對象，擬通過對培養(yǎng)基中多種營養(yǎng)成分及刺激因子的篩選與組合，優(yōu)化其發(fā)酵條件，以便提高細菌素的產(chǎn)量，為其應用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌M1-NTG300：實驗室誘導分離保藏菌種；

指示菌：金黃色葡萄球菌、熒光假單胞桿菌，黑龍江八一農(nóng)墾大學食品微生物實驗室；

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蛋白胨：生化試劑(BR)，青島海博生物技術有限公司；

葡萄糖、吐溫80、氯化鎂：分析純，天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DRP-9082型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SHP-250型，賽多利斯科學儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：722型，賽多利斯科學儀器有限公司；

超凈工作臺：BCN-1360型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-75KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

臺式多管架離心機：TD5A型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 無細胞發(fā)酵上清液的制備 對出發(fā)菌株活化24 h以后，用2%的接菌濃度(108～109CFU/mL)接入MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后(37 ℃)，離心(8 000 r/min，5 min)，除去菌體，用NaOH(5 mol/L)調上清液pH至 6.0～6.5，過濾膜(0.22 μm)，得到無細胞發(fā)酵上清液。

1.3.2 抑菌活性的測定 加熱指示菌固體培養(yǎng)基，待其融化冷卻至45～50 ℃后倒板，平板凝固后將牛津杯平均分布于內。加熱指示菌半固體培養(yǎng)基使其融化，冷卻至45～50 ℃。稀釋指示菌液濃度至10-2，在600 nm下檢測發(fā)酵液的OD值。用移液槍吸取50 μL指示菌液接入指示菌半固體培養(yǎng)基中后倒板。在平板完全凝固時拔出牛津杯，并于孔中添加50 μL發(fā)酵液。在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察是否有抑菌圈生成[16-17]。游標卡尺測量抑菌圈的直徑，采用Nisin效價標準曲線計算效價[18]。

1.3.3 單因素試驗設計

(1) 碳源濃度的影響：選擇葡萄糖作為培養(yǎng)基中的碳源，濃度分別為2%～4%等差分配，37 ℃培養(yǎng)24 h，以原MRS液體培養(yǎng)基平行對照。在葡萄糖濃度不同的MRS液體培養(yǎng)基中，接種M1-NTG300測抑菌性[19]。

(2) 氮源濃度的影響：選擇蛋白胨作為培養(yǎng)基中的氮源，濃度分別為2%～4%等差分配，37 ℃培養(yǎng)24 h，以原MRS液體培養(yǎng)基平行對照。在蛋白胨濃度不同的MRS液體培養(yǎng)基中，接種M1-NTG300測抑菌性。

(3) 不同濃度刺激因子的影響：選擇吐溫80作為培養(yǎng)基中的刺激因子，濃度分別為0.20%～0.40%等差分配，37 ℃培養(yǎng)24 h，以原MRS液體培養(yǎng)基平行對照。在吐溫80添加量不同的MRS液體培養(yǎng)基中，接種M1-NTG300測抑菌性。

(4) 金屬離子濃度的影響：選擇不同濃度MgCl2作為培養(yǎng)基中的金屬離子，濃度分別為0.05%～0.25%等差分配，37 ℃培養(yǎng)24 h，以原MRS液體培養(yǎng)基平行對照，接種M1-NTG300測抑菌性。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗的結果，通過Box-Behnken進行響應面法的試驗設計，對試驗進行進一步的優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分單因素試驗

2.1.1 碳源濃度對細菌素產(chǎn)量的影響 如圖1所示，當葡萄糖濃度不同時，細菌素分泌量及抑菌活性的增加在一定范圍內呈正相關，而隨葡萄糖濃度的繼續(xù)增大，細菌素效價和抑菌效果反而降低，分析原因可能是適宜濃度葡萄糖有利于細菌代謝繁殖，而外界葡萄糖濃度過高時滲透壓升高，導致細菌滲透作用失水而發(fā)生質壁分離影響其生長[20]。綜上，優(yōu)選3.5%作為最佳葡萄糖濃度。

2.1.2 氮源濃度對細菌素產(chǎn)量的影響 如圖2所示，細菌素效價及抑菌活性隨蛋白胨濃度的增加一定范圍內呈上升趨勢。蛋白胨濃度為3.0%時，植物乳桿菌素效價和抑菌活性均較好。蛋白胨濃度大于3.0%時，細菌素隨濃度增加小幅度下降。這可能是由于培養(yǎng)基中蛋白胨濃度或高，導致膜內外滲透壓不同，細胞膜內水分進入營養(yǎng)液，導致細胞生長受影響[21]。綜上，最佳蛋白胨濃度為3.0%。

圖2 氮源對細菌素產(chǎn)量的影響

2.1.3 刺激因子添加量對細菌素產(chǎn)量的影響 如圖3所示，細菌素效價及抑菌活性與吐溫80濃度在一定范圍內呈正相關，吐溫80不僅能提高細胞膜的通透性，減少表面張力，還能促進營養(yǎng)物質透壁代謝，增多的營養(yǎng)類物質對產(chǎn)生細菌素具有正向促進作用[22]。吐溫80濃度為0.30%時細菌素的產(chǎn)量最高，抑菌效果最顯著。之后，細菌素效價和抑菌性隨吐溫80濃度增大反而迅速減小，吐溫80濃度過高會造成細菌生長停滯甚至死亡[23]。綜上，選擇濃度為0.30%的吐溫80為最佳刺激因子。

圖3 刺激因子對細菌素產(chǎn)量的影響

2.1.4 金屬離子濃度對細菌素產(chǎn)量的影響 由圖4可知，隨著MgCl2濃度的增加，植物乳桿菌素效價和抑菌活性呈先上升而后下降的趨勢。當MgCl2添加量高達0.20% 時，細菌素的抑菌效果最佳，且效價最大。這可能是由于MgCl2對細菌細胞的結構穩(wěn)定性起重要作用[24-25]，但MgCl2濃度過高會造成體系滲透壓增大，而細菌調節(jié)體內Mg2+能力有限[26]。因此0.20% MgCl2可以作為優(yōu)產(chǎn)細菌素的最佳濃度。

圖4 金屬離子對細菌素產(chǎn)量的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面因素水平設計 根據(jù)單因素試驗結果，以植物乳桿菌素的效價為響應值，對葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、吐溫80添加量和MgCl2濃度設計響應面試驗，因素及水平見表1。

表1 響應面因素水平表

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析 采用Design-Expert 8.0.5.0軟件中的Box-Behnken程序進行試驗設計，結果見表2，方差分析結果見表3。對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到的二次回歸模型為：

表2 響應面法優(yōu)化試驗設計及結果

表3 回歸模型顯著性檢驗結果?

Y=0.58A+1.28B+0.46C-0.18D+1.02AB+0.82AC-1.72AD-1.50BC+3.32BD-3.10CD-2.47A2-3.80B2-2.62C2-4.48D2。

(1)

由表3可知，回歸模型顯著(P<0.05)，表明與實際情況擬合度好；模型的失擬項為0.598 8>0.05，表明在P=0.05水平上不顯著，說明殘差均由隨機誤差引起，對試驗干擾小，證明試驗的可靠性。預測值和真實值之間有較好的相關性，試驗誤差小，因此可用該方程對植物乳桿菌素效價進行預測。由F值可知，各因素對植物乳桿菌素效價影響大小先后順序為：B(蛋白胨濃度)>A(葡萄糖濃度)>C(吐溫80濃度)>D(MgCl2濃度)。

2.2.3 響應曲面交互作用分析 由圖5可知，效價隨因素值增大而升高，當達到曲面中心點極值時開始下降，蛋白胨濃度(B)和MgCl2濃度(D)及吐溫80濃度(C)和MgCl2濃度(D)兩量間交互作用所得到的響應面圖曲面較陡峭，且等高線皆為橢圓形，表明BD、CD交互作用顯著，與表3方差分析中顯著性試驗結果一致。表3方差分析表明其他4組交互作用均不顯著。

圖5 各因素交互作用對植物乳桿菌素效價影響的響應面及等高線圖

2.2.4 模型驗證實驗 結合回歸模型和響應面圖分析得出植物乳桿菌素的最佳培養(yǎng)條件是：葡萄糖濃度為3.476%，蛋白胨濃度為3.391%，吐溫80添加量為0.347%，MgCl2濃度為0.198%?？紤]實際試驗條件，確定最終植物乳桿菌素的培養(yǎng)條件葡萄糖濃度為3.5%，蛋白胨濃度為3.5%，吐溫80添加量為0.35%，MgCl2濃度為0.20%，在此條件下經(jīng)過5次重復性實驗驗證后得出，植物乳桿菌素的效價為(1 269.4±2.57) IU/mL。效價預測值與理論值1 270.5 IU/mL極接近，說明響應面分析所得的回歸模型是可靠的。

3 結論

培養(yǎng)基組分單因素試驗優(yōu)化結果顯示：植物乳桿菌M1-NTG300產(chǎn)細菌素的MRS培養(yǎng)基最佳組分為葡萄糖濃度3.5%、蛋白胨濃度3.0%、吐溫80濃度0.30%、氯化鎂濃度0.20%。在此基礎上，采用Box-Behnken試驗設計對其培養(yǎng)條件進行進一步優(yōu)化，經(jīng)驗證，該模型合理可靠。通過模型分析并結合實際值進行修正后，得到的最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖濃度3.5%、蛋白胨濃度3.5%、吐溫80濃度0.35%、氯化鎂濃度0.20%，此條件下植物乳桿菌M1-NTG300所產(chǎn)細菌素的效價為1 269.4 IU/mL，與未進行培養(yǎng)條件優(yōu)化前所產(chǎn)細菌素的效價(1 082.5 IU/mL)相比，提高了19.8%。有關研究[27-30]表明，細菌素的產(chǎn)量與細菌培養(yǎng)條件有關外，還受某些干預細菌素分析的誘導調控因素影響，因此后續(xù)試驗將考慮從氨基酸誘導、最小初始接菌濃度及信號分子(肽類物質或者蛋白類物質)等方面對進行深入研究，從而更全面探析影響植物乳桿菌M1-NTG300產(chǎn)細菌素的因素。