西替?zhèn)温榫忈屍宣}酸偽麻黃堿的人體藥動(dòng)學(xué)研究

金曉玲，高守紅，鄔 蓉(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003)

西替?zhèn)温榫忈屍瑸辂}酸西替利嗪和鹽酸偽麻黃堿組成的復(fù)方制劑。鹽酸偽麻黃堿是麻黃堿的差向異構(gòu)體，臨床所用的為右旋偽麻黃堿(PSE)，可選擇性收縮呼吸道血管，消除鼻黏膜水腫，在許多抗感冒藥中常常含有該成分［1，2］。本研究是以緩釋成分鹽酸偽麻黃堿為指標(biāo)觀(guān)察人單劑量口服西替?zhèn)温榫忈屍笱帩舛冉?jīng)時(shí)過(guò)程，估算相應(yīng)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。由于偽麻黃堿血藥濃度低，需要高靈敏方法進(jìn)行測(cè)定，而 HPLC 法［3～5］檢測(cè)靈敏度低，采用 GC-MS法［6］測(cè)定時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，操作煩瑣。采用 LC-MS 法［7，8］測(cè)定血漿中偽麻黃堿的濃度，雖然方法靈敏度有所提高，但重現(xiàn)性不好，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)。考慮到臨床生物樣本量大、穩(wěn)定性差、濃度低、專(zhuān)屬性要求高等特點(diǎn)，筆者建立了快速測(cè)定人血漿中偽麻黃堿的LC-MS/MS方法，1個(gè)樣品的測(cè)定時(shí)間僅需2.5 min，1 d能測(cè)定500多個(gè)樣品，快速而簡(jiǎn)便地分析大量的血漿樣品，為臨床試驗(yàn)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥品 Agilent 1200液相色譜-Agilent 6410型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司);Agilent 6410 B.01.03 定量處理軟件;飛鴿牌TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));旋渦振蕩混和器 WL-901 Vortex(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)。偽麻黃堿對(duì)照品(含量99.3%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。西替?zhèn)温榫忈屍?上海信誼藥業(yè)有限公司，批號(hào)090320);鹽酸金剛烷胺(內(nèi)標(biāo)，中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈和甲酸為色譜純?cè)噭?德國(guó)Merck公司);水為純凈水。

1.2 色譜分離條件 色譜柱為Agilent Zorbax SBC18(150 mm × 2.1 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液(40∶60)，流速為0.3 ml/min，柱溫為30℃。

1.3 質(zhì)譜分離條件 采用ESI離子源，正離子檢測(cè)，選擇MRM工作方式進(jìn)行一/二級(jí)質(zhì)譜分析。用于定量分析的檢測(cè)離子為:偽麻黃堿［M+H］+m/z 148.1→m/z 132.1，內(nèi)標(biāo)鹽酸金剛烷胺［M+H］+m/z152.0→m/z135.1，見(jiàn)圖1。干燥氣流速為 10 L/min，干燥氣溫度為350℃，霧化氣壓力為40 psi，毛細(xì)管電壓為4 000 V。

圖1 偽麻黃堿和內(nèi)標(biāo)的ESI-MS質(zhì)譜圖

1.4 受試者與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本臨床試驗(yàn)方案經(jīng)長(zhǎng)征醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，在試驗(yàn)過(guò)程中受倫理委員會(huì)指導(dǎo)，試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生。10名男性健康志愿者，年齡(21.8±1.22)歲，體重(66.8±3.9)kg，肝腎功能及心電圖正常，試驗(yàn)前1周及試驗(yàn)期間禁用其他藥物，試驗(yàn)期間禁煙、酒、茶并簽署知情同意書(shū)。在禁食12 h后，于次日晨空腹口服西替?zhèn)温榫忈屍?片(含鹽酸西替利嗪10 mg，鹽酸偽麻黃堿240 mg)，用200 ml溫開(kāi)水送服。服藥后4 h方可統(tǒng)一進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐。于給藥前及給藥后 0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 和36.0 h 于靜脈取血3 ml，3 500 r/min 離心10 min，分離血漿后置 －20 ℃冰箱保存。

1.5 血漿樣品預(yù)處理 取血漿200 μl置于 －1.5 ml塑料離心管中，加入400 μl乙腈(含內(nèi)標(biāo)鹽酸金剛烷胺5 ng/ml)，渦旋振蕩1min，于12 000 r/min高速離心 10 min，取上清液 200 μl加入 200 μl 0.1%甲酸溶液，渦旋混勻后取10 μl進(jìn)樣，峰面積內(nèi)標(biāo)法定量分析。

1.6 含量測(cè)定的方法學(xué)考察 用健康空白血漿精密配制成 2.5、5.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0和1 000.0 ng/ml濃度的偽麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按1.5項(xiàng)下方法操作，制備血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。配制5.0、50.0和500.0 ng/ml 3種不同濃度的偽麻黃堿血漿質(zhì)控樣品，按1.5項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行回收率、基質(zhì)效應(yīng)及日內(nèi)、日間精密度考察。還考察了偽麻黃堿血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)的穩(wěn)定性、血漿樣品經(jīng)樣品處理后室溫放置24 h的穩(wěn)定性以及血漿樣品在－20℃保存60 d的穩(wěn)定性。

1.7 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算 采用統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Cmax、tmax采用實(shí)測(cè)值，AUC采用梯形面積法計(jì)算，λz為末端相消除速率常數(shù)，用末端相濃度對(duì)數(shù)與時(shí)間回歸直線(xiàn)求得:t1/2=0.693/λz。

2 結(jié)果

2.1 方法專(zhuān)屬性 在上述色譜條件下，偽麻黃堿和內(nèi)標(biāo)峰形良好，偽麻黃堿和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.59 min和1.82 min(圖2)。血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)均不干擾藥物的測(cè)定。

2.2 方法學(xué)考察 結(jié)果表明偽麻黃堿在2.5～1 000.0 ng/ml濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為A=0.002 3C+0.003 4(r=0.995 2)。偽麻黃堿在血漿中最低定量檢測(cè)限為2.5 ng/ml，RSD為8.46%。低、中、高3種濃度的日內(nèi)及日間精密度分別＜5.7%和＜11.6%，萃取回收率 ＞78%，基質(zhì)效應(yīng)在103.0% ～107.7%之間。偽麻黃堿血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)后穩(wěn)定，RSD為9.54%;血漿樣品經(jīng)樣品處理后室溫放置24 h穩(wěn)定，RSD為8.91%。血漿樣品在－20℃保存60 d其濃度無(wú)明顯變化，說(shuō)明其在－20℃條件下，藥物在血漿中可穩(wěn)定存在。

2.3 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 10名健康志愿者單劑量口服西替?zhèn)温榫忈屍?含鹽酸西替利嗪10 mg，鹽酸偽麻黃堿240 mg)，用LC-MS/MS測(cè)定其血藥濃度，按“1.7”項(xiàng)方法計(jì)算，體內(nèi)鹽酸偽麻黃堿藥時(shí)曲線(xiàn)的末端相消除半衰期(t1/2)、平均駐留時(shí)間 (MRT)、峰濃度 (Cmax)、峰時(shí)間 (tmax)、AUC0～36、AUC0～∞分別為:(7.32 ± 0.97)h，(12.41 ± 1.46)h，(706.64 ±113.72)ng/ml，(6.8 ±1.0)h ，(9 269.72 ±1 598.13)ng·h/ml和(9 638.65 ±1 793.59)ng·h/ml。西替?zhèn)温榫忈屍宣}酸偽麻黃堿的體內(nèi)主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

3 討論

本文采用ESI正離子模式，對(duì)所測(cè)定的偽麻黃堿及其內(nèi)標(biāo)鹽酸金剛烷胺的電離條件進(jìn)行優(yōu)化，［M+H］+峰容易生成有規(guī)律的碎片，便于MS/MS測(cè)定，經(jīng)過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜和色譜條件，最終可以滿(mǎn)足偽麻黃堿及其內(nèi)標(biāo)鹽酸金剛烷胺血藥濃度的測(cè)定。

由于偽麻黃堿分子結(jié)構(gòu)中含有堿性氮原子，所以流動(dòng)相的pH值對(duì)其保留時(shí)間有一定影響。用甲醇-0.1%甲酸水溶液(40∶60)作為流動(dòng)相時(shí)分離效果最好。因偽麻黃堿為弱堿性藥物，通常合成鹽酸鹽可增加溶解度，其血樣的提取一般采用乙醚、乙醚-正乙烷、甲基叔丁基醚等有機(jī)溶劑提取，但常有乳化現(xiàn)象產(chǎn)生，操作過(guò)程煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，成本較高。而采用蛋白沉淀法進(jìn)行血樣處理，操作簡(jiǎn)單，選擇沉淀劑時(shí)，曾探討使用甲醇、乙腈等蛋白沉淀劑處理生物樣品，結(jié)果使用乙腈提取回收率較高，但若用上清液直接進(jìn)液質(zhì)，峰形不佳且響應(yīng)較低，將上清液用水、流動(dòng)相、0.1%甲酸、0.3%甲酸、0.5%甲酸分別1∶1和1∶2稀釋?zhuān)Y(jié)果發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸1∶1稀釋?zhuān)崛』厥章首罡?，達(dá)78%左右。本實(shí)驗(yàn)所需血漿樣品量少，前處理采用蛋白沉淀，操作簡(jiǎn)便，分析測(cè)定時(shí)間短，在處理大批量血漿樣品時(shí)可大大減少工作量和節(jié)省時(shí)間。

偽麻黃堿在人體血漿中的濃度較低，采用HPLC-UV法測(cè)定時(shí)，有時(shí)可觀(guān)察到少量雜質(zhì)干擾其低濃度測(cè)定。為保證臨床大量且復(fù)雜生物樣本分析的專(zhuān)屬性和準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)建立了偽麻黃堿人血漿樣本LC-MS/MS分析方法，可以選擇性的檢測(cè)選定的離子以及該離子所產(chǎn)生的子離子，因而選擇性很高，而對(duì)LC的分離要求不高，甚至可以不通過(guò)LC分離而直接將混合樣品進(jìn)入MS進(jìn)行測(cè)定，故可以實(shí)現(xiàn)快速分離?？瞻籽獫{無(wú)雜質(zhì)干擾，最低定量檢測(cè)濃度可達(dá)2.5 ng/ml，完全滿(mǎn)足臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)的要求。

［1］謝 林，梁 艷，劉曉東，等.西嗪偽麻緩釋膠囊中鹽酸偽麻黃堿在犬血漿中LC-MS法測(cè)定及其藥代動(dòng)力學(xué)［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35(6):528.

［2］張 鵬，張逸凡，陳笑艷，等.三種偽麻黃堿制劑在中國(guó)健康人體的藥動(dòng)學(xué)及生物等效性［J］.中國(guó)新藥雜志，2006，15(17):1491.

［3］Macek J，Ptacek P，Klima J.Rapid determination of pseudoephedrine in human plasma by HPLC［J］.J Chromatogr B，2002，766(2):289.

［4］張善堂，舒 冰，史天陸，等.高效液相色譜法測(cè)定人血漿中鹽酸偽麻黃堿濃度［J］.安徽醫(yī)藥，2006，10(2):110.

［5］張建軍，歐麗娜，李 偉，等.小青龍顆粒中麻黃堿及偽麻黃堿在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(12):1991.

［6］賀 豐，羅佳波，陳飛龍，等.GC－MS法研究麻黃湯中麻黃堿、偽麻黃堿的人體內(nèi)過(guò)程［J］.中藥新藥與臨床藥理，2004，15(5):336.

［7］樊志君.HPLC-MS測(cè)定人血漿中偽麻黃堿［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，13(6):108.

［8］史天陸，陳禮明，孫言才，等.健康人血漿中偽麻黃堿濃度的LC-MS 法測(cè)定［J］.安徽醫(yī)藥，2008，12(11):1045.