骨肉瘤組織中IMP3表達(dá)及MVD與患者臨床病理特征的關(guān)系

周偉，陳敬有，魏優(yōu)秀，李賀偉

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢 430000

骨肉瘤是一種發(fā)病率較高的原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高，起病早期即可發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，致殘率與致死率均處于較高水平[1]。骨肉瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)具有多階段的特性，是多因素相互作用的結(jié)果，其具體機(jī)制目前尚未完全明確[2]。胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA結(jié)合蛋白3(IMP3)是一種新發(fā)現(xiàn)的癌癥相關(guān)蛋白，生理情況下表達(dá)于胚胎組織中，罕見于成年機(jī)體的正常組織，但當(dāng)成年機(jī)體的細(xì)胞發(fā)生癌變時，會由于去分化現(xiàn)象而重新分泌胚胎時期特有的蛋白，因此IMP3被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于多種腫瘤組織中[3]。微血管密度(MVD)可以定量地反映血管生長情況，因此通常被認(rèn)為是血管生成強(qiáng)度最重要的指標(biāo)之一[4]。目前臨床上對于MVD值的檢測以CD34、CD31等血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)為主要手段[5]，本研究選擇在血管中表達(dá)較為廣泛的CD34為標(biāo)記物。本研究采用SP免疫組化法檢測骨肉瘤組織中IMP3、MVD的表達(dá)，探討IMP3、MVD在骨肉瘤的發(fā)生與惡性進(jìn)展過程中的作用，并預(yù)測其成為骨肉瘤相關(guān)腫瘤標(biāo)記物的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月～2019年12月本院收治的骨肉瘤患者70例，其中男42例、女28例，年齡9～39歲；<18歲29例，≥18歲41例；腫瘤直徑<5 cm者29例，≥5 cm者41例；病變部位：股骨20例，脛骨19例，肱骨12例，其他19例；Enneking分期Ⅰ期17例，Ⅱ期27例，Ⅲ期26例；39例未發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，31例出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為原發(fā)性骨肉瘤；患者臨床病歷資料完整，存檔蠟塊組織保存完好；術(shù)前未經(jīng)其他抗腫瘤治療；未合并其他影響免疫組化結(jié)果的疾病。

1.2 骨肉瘤組織中IMP3表達(dá)、MVD檢測

1.2.1 免疫組化染色 本研究中，IMP3檢測所用一抗為兔抗人IMP3多克隆抗體；MVD檢測以CD34標(biāo)記，一抗為兔抗CD34多克隆抗體；試劑均購自美國Santa公司。SP通用免疫試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司。以PBS作為陰性對照一抗。將存檔蠟塊標(biāo)本以4 μm為間隔，連續(xù)切片，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。于95 ℃修復(fù)抗原15 min，加入3%雙氧水以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。加入一抗，于4 ℃孵育過夜。加入羊抗兔IgG工作液，37 ℃孵育30 min。滴加鏈霉親和素工作液，37 ℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水，制片，封片。

1.2.2 結(jié)果判定 本研究染色結(jié)果判定均由兩位病理科高年資醫(yī)師獨(dú)立判定。若兩位醫(yī)師意見相左，則報請病理科主任判定，若仍不能確定結(jié)果則排除該病例。

IMP3陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，采用半定量法判定，于高倍(×400)光學(xué)顯微鏡下，取6個陽性細(xì)胞較多的視野，每個視野細(xì)胞數(shù)不少于100個，最終結(jié)果取各視野結(jié)果的算術(shù)平均數(shù)。將染色結(jié)果分為程度計分(無著色計0分，淡黃色至黃色計1分，棕黃色計2分，褐色計3分)與數(shù)目計分(染色細(xì)胞<5%計0分，5～30%計1分，>30～60%計2分，>60%計3分)。將兩項計分相乘作為染色總結(jié)果，≤1為陰性、>1為陽性。

MVD染色先于低倍(×40)光學(xué)顯微鏡下瀏覽切片，找尋血管密集、染色對比度較高的區(qū)域，再于高倍(×400)光學(xué)顯微鏡下計算血管數(shù)目。依照Weidner法[6]，將棕色染色的單個血管內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞束視為一個微血管數(shù)，但厚平滑肌層或管腔切面面積>8個紅細(xì)胞直徑的血管不計入。取6個不同視野，MVD值為6個視野的算數(shù)平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤和癌旁組織中IMP3表達(dá)、MVD比較 IMP3在骨肉瘤組織中陰性7例、陽性63例，癌旁組織中陰性43例、陽性27例，骨肉瘤組織中IMP3的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)。骨肉瘤和癌旁組織MVD值分別為55.97±9.64、48.02±3.93，骨肉瘤組織MVD值高于癌旁組織(P<0.05)。

2.2 骨肉瘤組織中IMP3表達(dá)和MVD與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 骨肉瘤組織中，IMP3的表達(dá)與性別、年齡、病變部位無關(guān)(P均>0.05)，而與腫瘤直徑、Enneking分期、肺轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)；MVD值與性別、年齡、病變部位無關(guān)(P均>0.05)，而與腫瘤直徑、Enneking分期、肺轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

2.3 骨肉瘤組織中IMP3表達(dá)和MVD的關(guān)系 IMP3在骨肉瘤組織中陰性7例、陽性63例，MVD值分別為45.11±7.62、57.19±9.09，骨肉瘤組織中IMP3和MVD的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.493，P=0.001)。

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，骨肉瘤的治療方法由單純的外科治療，轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ｖ委煘橹鹘Y(jié)合新輔助化療、外科治療、放療等手段的綜合診療方案[7,8]，患者的5年生存率因此從不足20%上升至60%～70%[9,10]，保肢率可達(dá)90%以上[11]。但近來患者的5年生存率改善遇到瓶頸，骨肉瘤對患者及其家屬造成的精神及經(jīng)濟(jì)壓力并沒有得到滿意的改善。尋找特異性高的骨肉瘤標(biāo)記物，建立敏感的早期診斷檢測方案，進(jìn)一步深入研究骨肉瘤的發(fā)生、惡性進(jìn)展的機(jī)制，以尋求治療方法的突破是臨床上迫切的需求。

表1 骨肉瘤組織中IMP3表達(dá)、MVD與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

IMP3最初被稱為“癌癥中過表達(dá)的K同源區(qū)控制蛋白”[3]，定位于染色體7p11.5，長度約64 kD。IMP3能與胰島素樣生長因子(IGF)Ⅱ mRNA的5′非翻譯區(qū)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)IGF Ⅱ mRNA的定位、翻譯及反轉(zhuǎn)錄作用[12,13]。IMP3在許多惡性腫瘤組織中均有表達(dá)，是近來研究的熱點之一。Yan等[14]發(fā)現(xiàn)，IMP3在非腫瘤肺組織中未見陽性表達(dá)，但在肺腺癌組織中陽性表達(dá)率上升至41.1%，且IMP3陽性表達(dá)的肺腺癌組織的惡性程度較高；El-Balat等[15]發(fā)現(xiàn)，IMP3僅在原發(fā)性卵巢交界性腫瘤中呈陽性表達(dá)，而在其他病理類型的卵巢組織中未見表達(dá)；Elshafey等[16]則證實，IMP3在涎腺黏液表皮樣癌中異常高表達(dá)，且與多種臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，但在其他類型的表皮樣癌中未見表達(dá)，是一種極具潛力的早期診斷、預(yù)后評估指標(biāo)。本研究結(jié)果中，IMP3在骨肉瘤組織中的陽性表達(dá)率較癌旁組織高，由此可以推斷IMP3與骨肉瘤的發(fā)生相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中IMP3的表達(dá)與腫瘤直徑、Enneking分期、肺轉(zhuǎn)移等反映腫瘤惡性程度的臨床病理參數(shù)有關(guān)，因此可以將IMP3視作與骨肉瘤的惡性程度相關(guān)，與前述IMP3在其他惡性腫瘤中的表現(xiàn)類似。

MVD值用免疫組化法標(biāo)記腫瘤組織內(nèi)微血管，后依據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)所計算出的單位面積中微血管的數(shù)目。MVD值能夠較為直觀地表現(xiàn)腫瘤組織的血管形成能力，被認(rèn)為是目前能夠反映腫瘤組織中血管生存活性的重要指標(biāo)[17]。而微血管的生成是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要步驟之一，與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。Yang等[18]通過對肝細(xì)胞癌的臨床研究發(fā)現(xiàn)，CD34標(biāo)記的MVD值與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等參數(shù)有關(guān)，且是肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素；田墨涵等[19]則發(fā)現(xiàn)CD34標(biāo)記的MVD值在結(jié)直腸癌組織中升高，且與結(jié)直腸癌的TNM分期、血行轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究同樣選擇檢測CD34標(biāo)記的MVD值，SP免疫組化染色結(jié)果顯示，骨肉瘤組織的MVD值高于癌旁組織，因此骨肉瘤組織中微血管的生存能力高于癌旁組織。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中MVD值與腫瘤直徑、Enneking分期等反映腫瘤惡性程度的臨床病理參數(shù)有關(guān)，且發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者M(jìn)VD值較未轉(zhuǎn)移者高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。可見MVD值能在一定程度上反映骨肉瘤的惡性程度。

張亞軍等[20]發(fā)現(xiàn)，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中IMP3與CD34標(biāo)記的MVD值均上升，且與腫瘤的惡性程度有關(guān)，IMP3的表達(dá)與MVD值呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中IMP3的表達(dá)與MVD值同樣呈正相關(guān)。骨肉瘤中IMP3與MVD的作用可能與其在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的作用相類似，同樣參與惡性腫瘤的發(fā)生，并在腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展中起促進(jìn)作用。

綜上所述，骨肉瘤組織中IMP3表達(dá)、MVD異常上調(diào)，且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。骨肉瘤組織中IMP3、MVD可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。聯(lián)合檢測IMP3、MVD的表達(dá)有可能成為骨肉瘤早期鑒別診斷、治療方案制定相關(guān)的生物標(biāo)記物。