青梗菜速俊109雜交種純度SSR分子標記鑒定

范偉強，王超楠，黃志銀，李 梅，張 紅，鄭思宇，徐營莉，華德平

(1.天津科潤蔬菜研究所,蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點實驗室，天津 300381；2.天津師范大學生命科學學院，天津 300387； 3.天津大學生命科學學院, 天津 300072)

青梗菜(BrassicarapaL.SSP. chinensis)，是小白菜的一種，原產(chǎn)于中國，因其具有生長期短、商品性好、方便烹飪、味道鮮美等優(yōu)點，深受人們喜愛，廣泛種植于世界各地。

種子純度是種子質(zhì)量的重要指標之一，直接影響品種產(chǎn)量及商品性。種子純度鑒定方法有很多，長期以來，形態(tài)學鑒定是重要的鑒定方法之一，此方法簡單、直觀，但存在周期長、易受環(huán)境影響、表型特征判斷不易把握等缺點[1]。同時，由于選育品種數(shù)目逐年增多及育種材料來源狹窄的影響，不同品種間的差異越來越小，可供品種鑒定用的特征性狀越來越少，經(jīng)常出現(xiàn)形態(tài)學鑒定法難以滿足實際應用需要的問題[2]。另外，很多品種還存在嚴重的休眠問題，更延長了純度鑒定周期，影響種子及時銷售。

近年來，分子標記鑒定方法被廣泛應用于種子的純度鑒定工作中，與形態(tài)學鑒定法相比，具有穩(wěn)定、準確、快速等優(yōu)點[3]。其中，SSR具有多態(tài)性豐富、重復性高、結果穩(wěn)定可信等優(yōu)勢，是被廣泛應用的分子標記之一[4]。目前，SSR分子標記已被成功應用于包括甘藍型油菜、蘿卜、棉花、玉米、水稻、大豆等[5-10]多種作物的種子純度鑒定中。速俊109是一個優(yōu)質(zhì)的青梗菜品種，具備株型直立、葉色綠、光澤度好、早熟高抗、適應性廣等特點，得到了市場的認可。但速俊109的種子休眠嚴重，無法通過形態(tài)學及時進行純度鑒定，本研究以SSR分子標記技術為基礎，設計篩選合適的引物，以期為速俊109種子純度鑒定提供快速、高效的解決方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青梗菜速俊109雜交種及其父本、母本；8份青梗菜速俊109雜交種樣品。試驗材料均由天津科潤蔬菜研究所大白菜研究室提供。

參考白菜基因組序列信息，設計72對SSR引物，使用Primer Premier 5.0軟件設計，由華大基因公司合成。

1.2 田間鑒定與DNA提取

供試材料播于試驗田，每份約2 000株，常規(guī)田間管理。待其長到7～9片真葉時，根據(jù)葉形、葉色、株型等形態(tài)特征進行純度調(diào)查統(tǒng)計。每份分為2個部分，第1部分為480株，在對應編號畦中順序調(diào)查，不挑選，統(tǒng)計假雜株(父本、母本及其他雜株)數(shù)，并取所有材料的心葉于離心管中，用于DNA提?。黄溆酁榈?部分，統(tǒng)計假雜株(父本、母本及其他雜株)數(shù)與檢測總數(shù)。

青梗菜速俊109雜交種及其父本、母本采用CTAB法提取DNA；8份青梗菜速俊109雜交種樣品采用堿裂解法提取DNA[11]。

注: F1為雜交種;M為DNA markerⅠ;a 1～a 42為F1代雜交種樣品。圖2 引物擴增結果

表1 分子標記技術鑒定結果與形態(tài)學鑒定結果對比

1.3 引物篩選

設計SSR引物72對，在青梗菜速俊109雜交種及其父本、母本之間篩選，篩選出具有多態(tài)性的引物。

PCR擴增反應體系：DNA模板2μL，正、反向引物各0.4μL，2×TaqMaster Mix 5μL，滅菌去離子水2.2μL。

PCR反應程序：94 ℃開始預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染，統(tǒng)計結果[12]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分子鑒定純度(%)=[(檢測株數(shù)-母本帶型數(shù)-父本帶型數(shù)-其他雜帶型)/檢測株數(shù)]×100%；

田間鑒定純度(%)=[(檢測株數(shù)-父本株數(shù)-母本株數(shù)-其他雜株數(shù))/檢測株數(shù)]×100%。

2 結果與分析

2.1 引物篩選結果

對72對SSR引物在青梗菜速俊109雜交種及其父本、母本間進行篩選，其中QGC-A 07-44引物對在雙親間及F1雜交種間表現(xiàn)出共顯性差異，條帶清晰、明顯，可用于純度鑒定。引物篩選結果如圖1,引物序列如下：

A 07-44-F:5′- ACT AAT TGG CAA TTA GTG GAT TGA CCC AAG-3′

A 07-44-R:5′- ACA AGA TCC TTG GTC CGA CAG AAA C-3′

注:1為父本;2為母本;F1為雜交一代。圖1 特異性引物篩選結果

2.2 雜交種純度SSR鑒定

利用引物QGC-A 07-44對8份青梗菜速俊109雜交種樣品進行純度鑒定，每份取480個樣本，典型條帶如圖2。其中對應的不符合F1帶型的條帶(包括父本、母本、其他帶型)的數(shù)量分別為：6、7、4、6、5、8、3、9，計算出純度分別為：98.75%、98.33%、99.17%、98.75%、98.96%、98.33%、99.37%、98.13%(表1)。

2.3 分子標記技術鑒定結果與形態(tài)學鑒定結果對比

利用形態(tài)學鑒定法對8份青梗菜速俊109雜交種樣品進行田間鑒定。480株部分的假雜株(父本、母本及其他雜株)數(shù)量分別為：4、2、1、3、0、1、0、4，對應的純度結果與分子標記技術鑒定結果相比較，差異分別為：0.83%、1.46%、0.73%、0.94%、1.04%、1.57%、0.63%、1.45%(表1)，偏差≤2%；8份雜交種樣品的檢測總株數(shù)分別為：1 921、1 935、2 032、1 879、1 936、2 126、1 946、2 318，其中假雜株(父本、母本及其他雜株)數(shù)總量分別為9、6、4、7、3、4、0、11，對應的純度結果與分子標記技術鑒定結果相比較，差異分別為：0.78%、1.36%、0.63%、0.88%、0.89%、1.48%、0.63%、1.40%(如表1)，偏差≤2%。

3 結論與討論

在種子生產(chǎn)過程中，品種多種多樣、繁種量巨大往往是現(xiàn)代育種工作中商品種種子純度鑒定工作的背景，采用形態(tài)學鑒定法鑒定種子純度，周期長且繁瑣，同時需要大面積土地和大量農(nóng)資作為物質(zhì)基礎，還易受天氣等外界因素的影響，本研究實現(xiàn)了利用分子標記技術鑒定青梗菜速俊109雜交種的純度，與形態(tài)學鑒定法相比，結果偏差≤2%，符合誤差允許范圍[13]，解決了通過傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定法鑒定種子純度時面臨的不足，提高了工作效率，保證了種子質(zhì)量。

本研究中，選取的單個樣本檢測數(shù)量為480，考慮到檢測結果的可靠性，以及時間、耗材的成本，最佳檢測樣本容量需要進一步試驗研究[14]。另外，利用分子標記技術鑒定純度結果略低于利用形態(tài)學鑒定的結果，可能是由于基因水平的差異不一定會導致表型性狀的差異，需要進一步探索研究。

長遠來看，我國種子經(jīng)營主體數(shù)量眾多，盡管相關部門對種業(yè)市場嚴格監(jiān)管，但銷售假冒偽劣種子、非法套牌現(xiàn)象時有發(fā)生。所以，保證種子貨真價實、保護育種者合法權益至關重要，分子檢測技術不僅可以檢測雜交種的純度，也可以實現(xiàn)種子真實性的檢測，為解決這些問題提供了有效的途徑，成熟分子檢測體系的建立將促進我國種業(yè)的健康發(fā)展。