紅托竹蓀優(yōu)良菌株篩選研究

龔光祿，桂 陽，黃萬兵，楊通靜，盧穎穎，劉宏宇，郎柳錄，朱國勝

(1.貴州省農(nóng)科院農(nóng)作物品種資源研究所/貴州省食用菌育種重點實驗室/貴州省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究中心，貴陽 550006；2.貴州利康農(nóng)科技有限公司，貴陽 550006)

紅托竹蓀(DictyophorarubrovolvataM. Zang et al.)，又名織金竹蓀，隸屬鬼筆科(Phallaceae)、竹蓀屬(Dictyophora)真菌[1]，為貴州最具特色的食用菌之一，是全省種植的重要品種。野生資源主要分布于貴州、云南等竹林下的腐殖土上，主產(chǎn)于貴州。紅托竹蓀風味獨特、營養(yǎng)豐富、價值高，而且子實體含有豐富的多糖[2]，具有較強的還原能力和抑制羥基自由基能力，同時具有明顯的體外抗氧化活性[3,4]，紅托竹蓀菌托中多糖組份DRVP 1對小鼠S 180肉瘤具有一定的抑制作用[5,6]。因此，該菌具有較高的食用保健價值，是食用菌中的佳品，有“蘑菇皇后”、“真菌之花”等美譽。

因其菌絲生長緩慢、遺傳穩(wěn)定性差、易退化，導致菌種很難傳代培養(yǎng)[7]。每年的菌種都要從野生資源或栽培資源中分離獲得，因菌株間的遺傳差異或者變異[8]，使得市場上生產(chǎn)流通的菌種較為混亂，且穩(wěn)定性差，導致紅托竹蓀產(chǎn)業(yè)產(chǎn)量不穩(wěn)定、品質波動大，還沒有形成穩(wěn)定的、貴州適栽的品種。因此，開發(fā)優(yōu)良菌種對貴州省紅托竹蓀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關重要。

本研究對貴州省內紅托竹蓀野生主要分布區(qū)和栽培主產(chǎn)區(qū)，通過資源調查與收集，共分離獲得56個菌株，進入室內保藏與評價時，部分菌株傳代培養(yǎng)不萌發(fā)，淘汰了26個菌株，剩余40個菌株開展相關試驗。擬通過室內評價、室外栽培，通過菌絲長速、長勢、拮抗以及農(nóng)藝性狀綜合評價，篩選出貴州的適栽優(yōu)良菌株用于生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 供式菌株

紅托竹蓀菌株由貴州省農(nóng)科院農(nóng)作物品種資源研究所(貴州省食用菌育種重點實驗室)提供，共40個菌株，其中35個野生菌株、5個為栽培菌株，見表1。

1.2 方 法

1.2.1母種培養(yǎng)特性試驗

將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上活化，以保證試驗中菌齡和接種量一致。取活化后0.5 cm2的菌種塊接種到PDA綜合培養(yǎng)基平板中央，在25 ℃恒溫、避光培養(yǎng)。試驗設3個重復，每天記錄菌絲生長速度、長勢、菌落邊緣特征等。當生長速度最快的菌株即將長滿平板時取出，測定菌落半徑，并對菌絲生長速度進行差異顯著性分析，篩選菌絲長勢較好的菌株。

1.2.2拮抗試驗

在無菌條件下，隨機將1.2.1篩選獲得的長勢較好的菌株進行拮抗實驗，對峙接種于PDA綜合培養(yǎng)基平板上，置于25 ℃恒溫箱中進行對峙避光培養(yǎng)，觀察有無拮抗反應，合并無拮抗反應的菌株，篩選有差異的菌株。

表1 供試紅托竹蓀菌株及來源

1.2.3原種培養(yǎng)特性試驗

將篩選得到的差異菌株接種到木屑原種培養(yǎng)基中，木屑培養(yǎng)基裝入200 mL的三角瓶，每瓶裝150 g，每個品種重復3次，其他方法同常規(guī)制種。接種后置于25 ℃恒溫避光培養(yǎng)，待菌種定植后，觀察菌絲長勢、密度等，當生長速度最快的菌株即將長滿三角瓶時取出，測定菌絲生長速度并進行差異顯著性分析，篩選菌絲長勢較好的菌株。

1.2.4優(yōu)良品種篩選試驗

于2015年將1.2.3復篩獲得的6個菌株YZS 014、YZS 020、YZS 022、YZS 026、ZS 037、YZS 048與織金縣購買的常規(guī)栽培菌種為對照菌株，進行栽培品比試驗。每菌株栽培1 m2，觀察播種后菌絲長勢、吃滿料時間、菌絲爬土時間天數(shù)、原基發(fā)生時間、子實體出菇時間，并記錄竹蛋特征、子實體特征、商品性狀、產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀。竹蛋、子實體、商品性狀特征等以每個竹蛋或子實體為調查對象，其他農(nóng)藝性狀將把1 m2的區(qū)域劃分為3塊進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。所有測試結果與對照菌株(ck)進行判定，篩選出優(yōu)質高產(chǎn)的優(yōu)良菌株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

菌絲生長速度(mm·d-1)=菌落半徑或長度/生長天數(shù)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 母種培養(yǎng)特性初篩分析

2.1.1菌絲形態(tài)特征

通過觀察所有菌株菌絲的形態(tài)特征可知，在供試的40種菌株中，存在4種菌落形態(tài)，如圖1所示。邊緣整齊、邊緣呈叢狀、邊緣波紋線以及不萌發(fā)(圖1 A)；菌絲尖端有直生和交叉狀生長(圖1 B)；顯微特征有粗壯分枝少和細密分枝多(圖1 C)。且菌落邊緣整齊的菌絲尖端直生、粗壯、分枝少，菌落邊緣不整齊的絲尖端交叉狀生長、細密、分枝多。

2.1.2菌絲生長特性

由不同菌株在母種培養(yǎng)基上的菌絲生長情況可知，在40個供試菌株中，除YZS 003和YZS 051未生長外，其余均有所生長。初選了菌絲生長速度每天大于0.5 mm的17個菌株進行下一步試驗，如表2所示。生長速度最快的YZS 014菌株在母種培養(yǎng)基中的速度為1.894 mm·d-1，較其他菌株差異顯著；其次是菌株YZS 026、YZS 022、YZS 020和YZS 048，之間差異不顯著；再次是菌株ZS 037、YZS 001、YZS 050、YZS 005、YZS 038、YZS 029、YZS 041、YZS 044、ZS 053、ZS 036、YZS 043和YZS 004，它們之間有差異，但差異不顯著。

注：A為菌落特征(A 1為邊緣整齊；A 2為邊緣呈叢狀；A 3為邊緣波紋線；A 4為不萌發(fā))； B為邊緣生長特征(80倍)(B 1為菌絲尖端直生；B 2為菌絲尖端交叉狀生長)； C為菌絲特征(1 000倍)(C 1為菌絲粗壯分枝少；C 2為菌絲細密分枝多)。圖1 菌絲在培養(yǎng)皿上菌落特征

2.2 拮抗試驗分析

將2.1.2初篩的17個菌株進行拮抗試驗分析，菌株YZS 014單獨為一類，與其他菌株間均存在著拮抗反應；菌株ZS 036、YZS 38、YZS 41間有拮抗但是不明顯，可分別為一類；其余菌株YZS 026和YZS 005，YZS 022、YZS 001和YZS 050，YZS 020和YZS 029，YZS 048和YZS 53，ZS 037和YZS 044，YZS 004和YZS 043之間能融合，各為一類，如圖2和表3所示。供試的17個菌株間有10種不同的菌株，按照生長速度擇優(yōu)的方法，選擇YZS 014、YZS 026、YZS 022、YZS 020、YZS 048、ZS 037、YZS 038、YZS 041、ZS 036和YZS 043這10個菌株進行下一步試驗分析。此外，菌株YZS 026、YZS 022、YZS 020和YZS 048雖在母種培養(yǎng)基中的生長特性差異不顯著，但拮抗反應表明仍為不同菌株。

2.3 原種培養(yǎng)特性復篩分析

將2.2中選出的10個菌株作為對象，進行原種培養(yǎng)特性分析。如表4所示，除了YZS 014和YZS 026有1瓶被污染外，其余均未被污染；不同菌株在木屑原種培養(yǎng)基中的長勢均較旺且雪白，但生長速度在0.05水平上存在較大差異，在0.01水平上除了ZS 036外，其余9個菌株間差異不顯著，因此菌株ZS 036被淘汰。

2.4 品比農(nóng)藝性狀終篩分析

將原種復篩中的9個菌株，并與母種培養(yǎng)特性中長勢前9的菌株進行對照，發(fā)現(xiàn)有5個野生菌株YZS 014、YZS 020、YZS 022、YZS 026、YZS 048和1個栽培菌株ZS 037，同時出現(xiàn)的母種和原種生長速度在前9的菌株。因此，最終以這6個菌株為出發(fā)菌株，以織金購買菌株為對照菌株(ck)，進行紅托竹蓀代料栽培品比試驗，通過菌絲生長特性與農(nóng)藝性狀分析最終篩選出優(yōu)良菌株。

表2 紅托竹蓀菌絲在母種培養(yǎng)基上生長情況

2.4.1菌絲生長特性分析

將上述菌株栽培種接種到玉米秸稈栽培料中，基質料厚度為20 cm，接種量為2.5 kg·m-2，然后每5 d觀察1次菌絲的長勢，以及菌絲長滿時間，并在第30天左右，對每個菌株的長勢，吃料深度進行測量并計算出日平均生長速度。結果如表5所示，在秸稈栽培料中不同菌株均未發(fā)現(xiàn)污染情況，且菌絲日平均生長速度為3 mm左右，且差異不顯著，一般50～60 d即可長滿基質料，菌絲長勢以菌株YZS 020和YZS 048較好，表現(xiàn)菌絲潔白、濃密、生長旺盛，爬土強、菌絲束較多，菌株YZS 026和ZS 037較差，表現(xiàn)為菌絲爬土能力弱、菌絲束少。

圖2 紅托竹蓀菌株間的拮抗情況

圖3 紅托竹蓀菌絲在木屑培養(yǎng)基中的生長情況

表3 紅托竹蓀菌株間的拮抗情況

2.4.2農(nóng)藝性狀分析

6月18日播種，播種后第2天即開始萌發(fā)并吃料，8月中旬大部分菌絲長滿，開始覆土，10月旬菌絲逐漸出土并紐結形成菌索，并進一步形成原基，原基形成后50 d左右開始破殼出菇，出菇后當天即可采收(如圖4)。統(tǒng)計分析了不同菌株的農(nóng)藝性狀，如表6所示，菌株YZS 020和YZS 048能夠較快形成原基，且原基數(shù)量遠遠高于對照菌株，有效竹蛋也較高，且只有YZS 020能正常出菇，產(chǎn)量達587.4 g·m-2，YZS 014、YZS 022雖然也出現(xiàn)了原基，但是原基數(shù)量較少，且后期會出現(xiàn)干癟等不正常竹蛋，也不能正常出菇，菌株YZS 026和ZS 037沒有原基發(fā)生。

表4 紅托竹蓀菌絲在母種培養(yǎng)基上生長情況

表5 紅托竹蓀菌絲在栽培基質料中菌絲生長特性

表6 紅托竹蓀不同菌株的農(nóng)藝性狀

圖4 紅托竹蓀不同菌株在不同生長發(fā)育階段特征

3 討 論

3.1 結 論

通過在紅托竹蓀野生資源分布區(qū)和栽種主產(chǎn)區(qū)收集獲得56個菌株，進行傳代培養(yǎng)首先淘汰掉不能連續(xù)培養(yǎng)的菌株，獲得40個菌株。然后逐一進行了母種培養(yǎng)特性的初選分析、篩選17個長勢較好，生長速度較快的菌株進行拮抗實驗合并無拮抗反應的菌株，獲得10個菌株進入到原種生長特性的復篩分析并與初篩結果進行對照，復篩出6個優(yōu)良菌株進行出菇?jīng)Q篩分析，最終篩選獲得2個適栽優(yōu)良菌株，YZS 020和YZS 048。

3.2 討 論

菌絲生長速度和生長勢是衡量食用菌品種優(yōu)劣的重要指標之一，試驗中母種培養(yǎng)基中生長速度較快的菌株在原種以及基質料中的生長速度并沒有明顯的優(yōu)勢，且產(chǎn)量并不是很高，如YZS 026和ZS 037，其菌絲長勢在母種和原種中的生長趨勢并不一致，且菌絲生長較快的菌株YZS 014在品比實驗中其農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量并不好。說明菌絲體生長速度與產(chǎn)量相關性不明顯，不能用其預測產(chǎn)量，這與王振河等[9]、杜萍等[10]的研究結果相一致。同時也說明在母種培養(yǎng)基上菌絲長勢好的菌株不一定在原種、栽培種中長勢也好，因此也不能用母種菌絲的長勢來預測原種的長勢。