偏穗鵝觀草(Roegneria komarovii)的分子核型

王子君，李景環(huán)，金 鳳

(內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010020)

小麥族(Triticeae Dumortier)中最大的屬是鵝觀草屬，全世界有130多種，廣泛分布于北半球的溫寒地帶[1]，在我國有70多種，主要分布于西北、西南和華北地區(qū)[2]。鵝觀草屬植物多數(shù)種類是優(yōu)良牧草，有些種還具有較強(qiáng)的抗逆性，可以作為小麥和禾本科牧草育種的重要基因資源。但是由于鵝觀草屬植物形態(tài)變異復(fù)雜，在與鵝觀草屬相似的屬之間以及鵝觀草屬內(nèi)種的劃分等方面，至今仍然存在分歧[1-5]。

有關(guān)鵝觀草屬的分類研究報(bào)道很多，許多學(xué)者采用了染色體核型分析的方法，該方法是染色體組分析的一種比較有效的方法，指對生物的染色體數(shù)目、大小、形態(tài)和隨體等特征進(jìn)行分析[6-14]，因此得到了大多數(shù)分類學(xué)家和細(xì)胞遺傳學(xué)家的認(rèn)可。但是，普通的核型分析技術(shù)在染色體來源以及同源染色體配對方面，還存在一定的不確定性。近十幾年來，染色體熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization,FISH)的發(fā)展和應(yīng)用，使得該方法在物種分類、起源和進(jìn)化等的研究中得到青睞[15-21]。

45 S rDNA是高度保守的重復(fù)序列。FISH技術(shù)染色體定位時，45 S rDNA 一般分布于有隨體的染色體的次縊痕區(qū)域，在核型分析中對區(qū)分染色體類型是比較有用的細(xì)胞學(xué)依據(jù)[15-18]。5 S rDNA 也是高度保守的重復(fù)序列，但是它在染色體上的位置沒有明顯特征，是隨物種不同而不同[17-20]。pAs 1 DNA一般分布在染色體末端或者著絲粒處，在不同物種中，其差異顯示在pAs 1 DNA拷貝數(shù)的多少和分布位置上。這幾種重復(fù)序列常被用來制備染色體熒光原位雜交的探針，從而來研究物種的起源、分類與進(jìn)化。

偏穗鵝觀草(Roegneriakomarovii)是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)鵝觀草屬(Roegneria)多年生優(yōu)良牧草，在新疆、蒙古、蘇聯(lián)中亞和西伯利亞等地均有分布，大多數(shù)生長于海拔1 800～2 900 m處。有關(guān)偏穗鵝觀草的細(xì)胞學(xué)研究未見報(bào)道。在本試驗(yàn)中，借助熒光原位雜交技術(shù)對偏穗鵝觀草的染色體進(jìn)行的5 S rDNA和45 S rDNA以及pAs 1 DNA的定位，進(jìn)而相對準(zhǔn)確地對偏穗鵝觀草的染色體組進(jìn)行分子核型分析，為偏穗鵝觀草的遺傳育種提供一定的細(xì)胞學(xué)信息，在細(xì)胞學(xué)水平上為鵝觀草的分類及系統(tǒng)進(jìn)化補(bǔ)充信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

偏穗鵝觀草種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供。分別帶有5 S rDNA、45 S rDNA和pAs 1 DNA的質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

圖1 偏穗鵝觀草染色體5 S rDNA定位的中期染色體形態(tài)圖和核型圖

圖2 偏穗鵝觀草染色體45 S rDNA定位的中期染色體形態(tài)圖和核型圖

1.2 方 法

1.2.1偏穗鵝觀草染色體標(biāo)本的制備

1) 材料培養(yǎng)及處理。

在加水的培養(yǎng)皿中放置數(shù)粒飽滿的偏穗鵝觀草種子，置于25 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)，當(dāng)根尖長度為1.5～2 cm時，將根尖剪下經(jīng)過預(yù)處理、固定、解離、軟化、染色和壓片等過程，制備染色體玻片。

2) 冰凍揭片。

選擇染色體分散較好的玻片放入-20 ℃冰箱中儲存24 h后揭片脫水，將玻片放在無水乙醇中20～30 min后取出在室溫下晾干備用。

1.2.2探針的標(biāo)記

通過DNA切口平移法，用地高辛-dUTP標(biāo)記5 S rDNA探針和pAs 1 DNA探針，用生物素-dUTP標(biāo)記45 S rDNA探針。

1.2.3原位雜交與圖片采集

原位雜交參照李景環(huán)等[16]和裴自友等[18]的方法進(jìn)行。

采用日本產(chǎn)OLYMPUS-BX 53熒光顯微成像系統(tǒng)100倍油鏡下對染色體分散好的細(xì)胞進(jìn)行圖像采集。

1.2.4核型分析

采用Karyo 3.1軟件對染色體進(jìn)行長度測量，結(jié)合熒光標(biāo)記特征對染色體進(jìn)行配對。選擇5個染色體分散好的細(xì)胞，測量染色體的短臂(p)長度，長臂(q)長度以及總長度，每條染色體測量3次取平均值，計(jì)算每一對染色體短臂(p)長度，長臂(q)長度以及總長度的平均值，得出染色體的絕對長度、相對長度和臂比。用Excel軟件分析制作染色體核型模式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目的確定

通過對偏穗鵝觀草分散良好且結(jié)構(gòu)清晰的中期染色體進(jìn)行鏡檢觀察，選擇30個細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，以85%以上細(xì)胞的染色體數(shù)確定為偏穗鵝觀草的染色體數(shù)目2 n=28。

2.2 染色體核型特征

利用Karyo 3.1軟件進(jìn)行染色體長度測量和同源染色體配對。日本產(chǎn)OLYMPUS-BX 53熒光顯微成像系統(tǒng)拍攝的染色體圖及核型圖見圖1、圖2、圖4，對圖1和圖2進(jìn)行合并得到圖3。

圖3 偏穗鵝觀草染色體5 S rDNA和45 S rDNA定位的中期染色體形態(tài)圖和核型圖

圖4 偏穗鵝觀草染色體pAs 1 DNA定位的中期染色體形態(tài)圖和核型圖

由核型圖(圖1、圖2和圖4)可以看出，在配對的染色體中，中部著絲粒(m)類型的染色體有13對，近中部著絲粒(sm)類型的染色體有1對，其中m類型染色體中第6號短臂、第14號染色體長臂具隨體。

2.3 5 S rDNA、45 S rDNA和pAs 1 DNA在染色體上的定位

從圖1到圖4可看出，在熒光顯微鏡下，被DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)復(fù)染后，染色體呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；被地高辛-dUTP標(biāo)記的5 S rDNA和pAs 1 DNA應(yīng)該呈現(xiàn)出紅色熒光，但與背景染色體的藍(lán)色組合后，紅色變淡，呈現(xiàn)出粉紅色熒光；生物素-dUTP標(biāo)記的45 S rDNA應(yīng)該呈現(xiàn)的綠色熒光，同樣與背景染色體的藍(lán)色組合后呈現(xiàn)出亮綠色熒光。結(jié)果顯示，5 S rDNA在2對染色體上有雜交信號，分別位于第6對染色體的短臂上和第11對染色體的長臂上(圖1)；有2對染色體檢測到45 S rDNA雜交信號，分別位于第6對染色體的短臂上和第14對染色體的短臂上(圖2)；有8對染色體檢測到明顯的pAs 1 DNA的熒光信號，4對染色體表現(xiàn)出較弱的pAs 1 DNA熒光信號，有2對染色體(第8對染色體、第13對染色體)未檢測出熒光信號(圖4)；5 S rDNA和45 S rDNA的雙色雜交定位中，可以看出在第6對染色體的短臂上同時出現(xiàn)了5 S rDNA和45 S rDNA的熒光信號。5 S rDNA在遠(yuǎn)離著絲粒端，45 S rDNA在近著絲粒處，但是5 S rDNA和45 S rDNA緊密連鎖。

2.4 偏穗鵝觀草染色體核型參數(shù)

用Excel軟件對染色體相對長度和臂比進(jìn)行計(jì)算，得到偏穗鵝觀草中期染色體核型參數(shù)表和核型模式圖(表1和圖5)。

圖5 偏穗鵝觀草染色體核型模式圖

表1 偏穗鵝觀草染色體核型參數(shù)

由表1可知，偏穗鵝觀草的體細(xì)胞染色體數(shù)為2 n=28，染色體組總長度為104.785μm，染色體的絕對長度變異范圍是10.806～5.323μm，平均絕對長度為7.485μm，相對長度范圍為10.313 %～5.079%，最長染色體與最短染色體長度比為2.030，偏穗鵝觀草染色體核型公式為2 n=4 x=28=26 m(4 SAT)+2 sm。

3 討論與結(jié)論

3.1 偏穗鵝觀草核型

本研究表明，偏穗鵝觀草染色體數(shù)為2 n=28，有2對具隨體的染色體，隨體分別位于第6號、第14號染色體的短臂上。染色體組總長度為104.785μm，染色體的絕對長度變異范圍為10.806～5.323μm，平均絕對長度為7.485μm，相對長度范圍為10.313%～5.079%，最長染色體與最短染色體長度比為2.030。臂比大于2∶1的染色體有0組，所占比例為0，根據(jù)這2項(xiàng)主要特征可以判斷偏穗鵝觀草的核型類型屬于Stebbins核型分類中的1B型。核型不對稱系數(shù)為56.01%。因而，偏穗鵝觀草染色體核型公式為2 n=4 x=28=26 m(4 SAT)+2 sm。

小麥族牧草染色體基數(shù)為x=7[7]，本研究中的偏穗鵝觀草染色體數(shù)為28條，為四倍體(2 n=4 x=28)，核型的構(gòu)成是以中部著絲粒染色體為基礎(chǔ)，與多數(shù)已知染色體數(shù)目的鵝觀草屬植物相似。

孫根樓等[2]在1992年報(bào)道的偏穗鵝觀草的核型公式2 n=24 m+2 sm+2 sat，核型類型2 A，以及隨體出現(xiàn)于第12對sm型染色體上；本研究結(jié)果與之不同。本研究認(rèn)為，偏穗鵝觀草的染色體雖然只有28條，但是有些染色體僅從形態(tài)大小特征來看，染色體間的特征差異不明顯，如果單純采用普通染色體制片法進(jìn)行核型分析，可能會給計(jì)算染色體的核型參數(shù)帶來一定程度的不確定性，因此對染色體進(jìn)行核型分析時會有一定的誤差，可以結(jié)合其他的方法手段輔助分類，以便減少誤差。如結(jié)合特定的熒光標(biāo)記，進(jìn)行染色體的配對會相對更加準(zhǔn)確，而且更具科學(xué)性。

3.2 原位雜交

熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)中最重要的是有效的探針標(biāo)記[13,16]。實(shí)驗(yàn)中，要根據(jù)熒光信號的強(qiáng)弱適當(dāng)改變探針的使用量，使其在中期染色體上出現(xiàn)清晰且明亮的FISH雜交信號[13-18]。

本研究中，5 S rDNA檢測到的FISH雜交信號為4個，分別位于第6對染色體的短臂上和第11對染色體的長臂上，第6對染色體上的熒光信號比較強(qiáng)，第11對染色體上的熒光信號比較微弱；45 S rDNA 在偏穗鵝觀草染色體上檢測到了6個熒光信號，其中4個清晰且明亮，位于第6對染色體的短臂上和第14對染色體的短臂的端部，2個比較弱的熒光信號，位于第5對染色體的短臂的端部；5 S rDNA和45 S rDNA的雙色熒光原位雜交技術(shù)結(jié)果顯示，5 S rDNA和45 S rDNA的雜交信號強(qiáng)弱不同，在第6對染色體的短臂上同時出現(xiàn)了5 S rDNA和45 S rDNA的熒光信號，5 S rDNA在遠(yuǎn)離著絲粒處，45 S rDNA在近著絲粒處，但是二者間距較短，其余5 S rDNA和45 S rDNA的雜交信號則位于不同染色體上，利用5 S rDNA和45 S rDNA的熒光標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確識別4對同源染色體，在不同的染色體上5 S rDNA和45 S rDNA不僅存在著量的差異，而且也存在著位置的差異，能夠提高核型配對的準(zhǔn)確率。而pAs 1 DNA的FISH雜交信號則有28個清晰明亮的點(diǎn)(一條染色體上可能有2個及以上的信號點(diǎn))，以及一些較微弱且彌散的信號。pAs 1 DNA在偏穗鵝觀草染色體上的雜交信號強(qiáng)弱不一，有的信號強(qiáng)，有的信號比較弱，是因?yàn)榭截悢?shù)越多信號相對就越強(qiáng)[20]。以上標(biāo)記特征為染色體的同源配對提供了明確標(biāo)識。

根據(jù)已檢測到的 45 S rDNA、5 S rDNA以及pAs 1 DNA的FISH 雜交信號數(shù)目以及位置可以明確地區(qū)分開5對同源染色體，一定程度地提高了核型分析的準(zhǔn)確度[19]。但是由于pAs 1 DNA有些雜交信號不明晰，而且有一些染色體上沒有該標(biāo)記信號，給同源配對帶來了困難。想要對偏穗鵝觀草進(jìn)行更準(zhǔn)確地同源配對，有待開發(fā)一些其他序列的標(biāo)記，以確保染色體配對的準(zhǔn)確性和核型分析的精確性與一致性。

3.3 結(jié) 論

本次研究確定偏穗鵝觀草的染色體數(shù)目為28，為四倍體。偏穗鵝觀草的核型公式為2 n=4 x=28=26 m(4 SAT)+2 sm，核型類型屬于1 B型，經(jīng)過計(jì)算得出其核型不對稱系數(shù)為56.01%，判斷偏穗鵝觀草染色體屬于較保守的類型。

在偏穗鵝觀草中，5 S rDNA分別位于第6對染色體的短臂上和第11對染色體的長臂上；45 S rDNA分別位于第6對染色體的短臂上和第14對染色體的短臂上；有8對染色體檢測到明顯的pAs 1 DNA的熒光信號，大多分布于染色體的端部，少數(shù)定位于著絲粒區(qū)域。熒光原位雜交技術(shù)大大提高了染色體核型分析的可靠性，為鵝觀草屬植物的屬內(nèi)分類提供了細(xì)胞學(xué)資料[22]。