人工老化處理對芥藍(lán)種子生理生化特性的影響

屈煜瑩，黃 鑫，徐強(qiáng)輝，何紹恒，柴喜榮，康云艷，楊 暹，趙普艷

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2.廣州市農(nóng)業(yè)機(jī)械化技術(shù)推廣站，廣東 廣州 510405)

種子活力是衡量種子質(zhì)量的指標(biāo)之一，是確保植物在田間快速和整齊出苗的核心因素，主要表現(xiàn)為種子承受長期儲存的能力和應(yīng)對有害物質(zhì)的產(chǎn)生導(dǎo)致種子老化的能力[1]。一般認(rèn)為，活力高的種子更早萌發(fā)，有較高的發(fā)芽率，并且在逆境中生長優(yōu)勢與潛力更顯著。種子壽命主要由自身的遺傳特性、種子發(fā)育期間的環(huán)境因素、貯藏條件以及與種子壽命有關(guān)的基因決定[2]，并且種子活力和種子產(chǎn)量的加性基因效應(yīng)比非加性效應(yīng)更為普遍，可以改善種子活力、種子產(chǎn)量和種子質(zhì)量[3]。因此，防止種子劣變或在儲藏期間減少種子活力的損秏，對季節(jié)性變化的生產(chǎn)至關(guān)重要[4]。通過對種子生理生化指標(biāo)變化及相關(guān)基因的研究，了解調(diào)控種子壽命的生理及分子機(jī)制，對減緩種子老化進(jìn)程和延長種子壽命具有重要意義。

一般認(rèn)為，膜脂過氧化作用以及自由基增生是引起種子發(fā)生劣變老化的主要原因。種子劣變過程中，細(xì)胞膜透性增加、合成代謝能力下降、線粒體形態(tài)改變，同時(shí)SOD、POD和過氧化氫酶(CAT)等保護(hù)性酶的活性降低[2,5]。研究表明，活性氧ROS在調(diào)控種子的休眠、胚乳的活動(dòng)和促進(jìn)貯藏物的代謝中有一定作用，ROS的過度積累將轉(zhuǎn)變?yōu)橛泻ξ镔|(zhì)，抑制種子萌發(fā)，通過抗氧化系統(tǒng)的激活可以清除ROS[6]。朱誠等研究認(rèn)為，ROS在破壞生物大分子水膜的連續(xù)界面時(shí)，暴露了生物膜，并且容易受到活性氧自由基的攻擊，使貯藏期間的種子膜脂過氧化作用加強(qiáng)，并且不斷積累有毒物質(zhì)，導(dǎo)致種子活力下降[7]。適度降低種子的水分含量，可以降低膜脂過氧化的程度，從而保持種子活力。薄麗萍對不結(jié)球白菜種子進(jìn)行人工老化處理發(fā)現(xiàn)，隨著老化時(shí)間的增加，種子SOD和CAT活性均降低[8]。顧炳朝等發(fā)現(xiàn)，在人工老化的后期，POD、SOD和CAT等抗氧化酶活性均下降，種子消除過氧化氫的能力也降低，從而導(dǎo)致過氧化氫的積累[9]。

芥藍(lán)是華南地區(qū)重要的特色蔬菜之一。芥藍(lán)的種子壽命較短，華南地區(qū)高溫高濕頻發(fā)的條件，不利于芥藍(lán)種子活力的長期保持。目前，關(guān)于芥藍(lán)種子活力的研究很少，因此，本試驗(yàn)采用人工老化處理方法，研究不同遺傳特性的芥藍(lán)種子在不同時(shí)間老化處理下的種子活力及生理生化特性，通過分析種子活力及生理生化的變化規(guī)律，以期揭示種子的劣變機(jī)理，篩選種子活力相關(guān)指標(biāo)，為延緩種子老化進(jìn)程和延長種子壽命提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以5個(gè)芥藍(lán)品種為試驗(yàn)材料，分別為1號(黃花粗條大苔芥蘭)、2號(翠美芥蘭F1)、3號(綠寶芥藍(lán))、4號(夏翠芥藍(lán))和5號(翠豐芥蘭)。試驗(yàn)于2019年上半年在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子人工老化

芥藍(lán)種子的人工加速老化處理，參考鄭光華等[10]的方法。將芥藍(lán)種子放于40 ℃、相對濕度為100%的培養(yǎng)條件下，分別進(jìn)行0、2、4、6、8 d的老化處理，獲得不同老化程度的種子。

1.2.2種子活力的測定

在進(jìn)行人工老化處理實(shí)驗(yàn)之前，對芥藍(lán)種子和干燥器等工具進(jìn)行清洗和消毒。其中種子采用10%的NaOCl浸泡10 min進(jìn)行消毒。將干燥器放入40 ℃恒溫培養(yǎng)箱1 d平衡溫度之后，在紗布上放入已消毒的芥藍(lán)種子進(jìn)行高溫處理。處理完成后，取出種子放在陰涼環(huán)境下干燥1～2 d。取干燥的種子平鋪在培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽率的測定，發(fā)芽條件設(shè)定為20 ℃、無光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。在第3、4、5、7天分別記錄種子的發(fā)芽粒數(shù)。第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并對各處理隨機(jī)選取長勢優(yōu)良的幼苗，測量其下胚軸長度，根據(jù)測定的種子發(fā)芽數(shù)和下胚軸長度，計(jì)算種子的活力指數(shù)。

發(fā)芽勢(%)=(4 d時(shí)發(fā)芽總數(shù)÷90)×100%；

發(fā)芽率(%)=(7 d時(shí)發(fā)芽總數(shù)÷90)×100%；

活力指數(shù)=∑(Gt/Dt)×S/100%。

式中：Gt為第t日種子的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)，S為平均下胚軸長(cm)。

1.2.3生理指標(biāo)的測定

通過對芥藍(lán)種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和種子活力的測定，篩選出3號綠寶芥藍(lán)、4號夏翠芥藍(lán)、5號翠豐芥蘭進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。

相對電導(dǎo)率測定：稱取各處理干種子材料0.3 g，用蒸餾水沖洗3次，并用濾紙吸干種子表面的水分。將種子裝入試管中加入50 mL蒸餾水充分混勻，放置在20 ℃環(huán)境條件下浸泡12 h，用電導(dǎo)率儀DDS-307測定浸出液電導(dǎo)率。將種子及其浸泡液放置在100 ℃水浴鍋中煮沸10 min，冷卻至室溫后測定煮沸后的浸出液電導(dǎo)率。并計(jì)算相對電導(dǎo)率。

采用蒽酮比色法[11]、考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[11]、硫代巴比妥酸(TBA)法[11]分別測定種子的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和MDA含量。采用NBT法[12]和愈創(chuàng)木酚法[12]分別測定SOD活性和POD活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和作圖，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工老化對芥藍(lán)種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和種子活力的影響

由圖1可以看出，供試品種發(fā)芽勢均隨老化處理時(shí)間的延長而降低。其中2號和5號品種發(fā)芽勢緩慢降低，4號品種次之，1號和3號品種在4 d時(shí)發(fā)芽勢表現(xiàn)出更大的下降程度。老化處理0 d時(shí)，5個(gè)品種發(fā)芽勢差距不大，均在80%左右。老化處理2 d時(shí)，1號和5號品種發(fā)芽勢均在70%以上，而2號品種發(fā)芽勢最低(為51.11%)。老化處理4 d時(shí)，2號、4號、5號品種發(fā)芽勢穩(wěn)定在40%以上，其中5號品種發(fā)芽勢最高(達(dá)62.22%)。而1號和3號品種發(fā)芽勢出現(xiàn)急劇降低，3號品種發(fā)芽勢降低至3.33%，說明在2～4 d的老化處理期間，種子已明顯受到高溫高濕環(huán)境影響，種子生活力降低。老化處理6 d后，2號和5號品種發(fā)芽勢較高，1號和4號品種發(fā)芽勢較低，3號品種種子已喪失生活力。老化處理8 d后，5號品種發(fā)芽勢最高(達(dá)18.89%)，3號品種發(fā)芽勢最低(為0)。

圖1 人工老化處理下芥藍(lán)種子的發(fā)芽勢

由圖2可以看出，1、2、3、4、5號品種發(fā)芽率均隨老化處理時(shí)間的延長而降低。0 d老化處理中，5個(gè)品種發(fā)芽率均在80%以上，5號品種發(fā)芽率達(dá)93.33%。2 d老化處理中，1號和5號品種發(fā)芽率均在80%以上，而2號品種發(fā)芽率最低(為68.89%)。4 d老化處理中，2號和5號品種發(fā)芽率穩(wěn)定在60%以上，4號品種次之(為48.89%)。而1號和3號品種發(fā)芽率出現(xiàn)急劇降低，3號品種發(fā)芽率降低至3.33%。6 d老化處理中，2號和5號品種發(fā)芽率較高，1號和4號品種發(fā)芽率較低，3號品種種子已不表現(xiàn)生活力。8 d老化處理中，5號品種發(fā)芽率最高(達(dá)24.45%)，3號品種發(fā)芽率最低(為0)。

由圖3可以看出，5個(gè)品種活力指數(shù)均隨老化處理時(shí)間的延長而降低。其中2號和5號品種緩慢降低，4號品種次之，1號和3號品種在4 d時(shí)活力指數(shù)顯示急速降低。0 d老化處理中，5個(gè)品種活力指數(shù)均在70以上。2號品種活力指數(shù)最高(為90.04)。2 d老化處理中，1、3、4、5號品種活力指數(shù)均在60以上，而2號品種活力指數(shù)最低(為50.27)。4 d老化處理中，2號、5號品種活力指數(shù)穩(wěn)定在40以上，其中5號品種活力指數(shù)達(dá)到56.06，4號品種次之，活力指數(shù)為34.58，而1號和3號品種活力指數(shù)出現(xiàn)急劇降低，1號品種活力指數(shù)降低至12.87，3號品種活力指數(shù)降低至0.22，說明在2～4 d的老化處理期間內(nèi)，種子活力降低已沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。6 d老化處理中，2號和5號品種活力指數(shù)較高，1號和4號品種活力指數(shù)較低，3號品種種子已無活力。8 d老化處理中，5號品種活力指數(shù)最高(達(dá)13.26)，1號和4號品種活力指數(shù)幾乎為0，3號品種活力指數(shù)最低(為0)。

圖2 人工老化處理下芥藍(lán)種子的發(fā)芽率

圖3 人工老化處理下芥藍(lán)種子的種子活力

2.2 人工老化對芥藍(lán)種子相對電導(dǎo)率的影響

由圖4可看出，3、4、5號品種的相對電導(dǎo)率均隨老化處理時(shí)間的延長而增加。其中3號品種增加趨勢明顯，4號次之，5號增加趨勢緩慢。在0 d處理中，3號品種相對電導(dǎo)率為36%，4號品種為38%，5號品種為43%。在3 d處理中，3號品種相對電導(dǎo)率增加幅度最大(為29%)，5號品種增加幅度最小(為10%)。在6 d處理中，3號品種相對電導(dǎo)率達(dá)到最大(為83%)，相對于0 d處理增加幅度為47%，4號品種次之，增加幅度為39%，5號品種增加幅度最小(為29%)。

2.3 人工老化對芥藍(lán)種子可溶性糖含量的影響

由圖5可看出，3號、5號品種的可溶性糖含量均隨老化處理時(shí)間的延長而降低。其中3號品種降低趨勢明顯，4號品種表現(xiàn)出先增后降，5號品種降低趨勢緩慢。在0 d處理中，3號品種可溶性糖含量為6.62%，4號品種為4.72%，5號品種為5.00%。在3 d處理中，3號品種可溶性糖含量降低幅度為1.6%，4號品種有所提升(增幅為0.66%)，5號品種降低幅度最小(為1.02%)。在6 d處理中，3號品種可溶性糖含量相對于0 d處理降低了3.94%，4號品種相對于3 d處理降低幅度2%，5號品種降低幅度為2.18%。

圖4 人工老化處理下芥藍(lán)種子的相對電導(dǎo)率

圖5 人工老化處理下芥藍(lán)種子的可溶性糖含量

2.4 人工老化對芥藍(lán)種子可溶性蛋白含量的影響

由圖6可看出，3號、5號品種的可溶性糖含量均隨老化處理時(shí)間的延長而升高。其中3號品種增加趨勢明顯，4號品種表現(xiàn)出先降后增的變化趨勢，5號品種增加趨勢緩慢。在0 d處理中，3號品種可溶性蛋白含量為0.44 mg·g-1，4號品種為0.74 mg·g-1，5號品種為0.53 mg·g-1。在3 d處理中，3號品種可溶性蛋白含量增加幅度為32%，4號品種有所降低(減幅為9.00%)，5號品種增加幅度最小(為9.00%)。在6 d處理中，3號品種可溶性蛋白含量相對于0 d處理增加了87%，4號品種相對于3 d處理增加幅度為53%，5號品種相對于0 d處理增加幅度為55%。

2.5 人工老化對芥藍(lán)種子MDA含量的影響

由圖7可看出，3、4、5號品種的MDA含量均隨老化處理時(shí)間的延長而升高。其中3號品種增加趨勢明顯，4號品種次之，5號品種增加趨勢緩慢。在0 d處理中，3號品種MDA含量為2.76μmol·g-1，4號品種為3.85μmol·g-1，5號品種為2.15μmol·g-1。在3 d處理中，3號品種MDA含量增加幅度最大，4號品種增加幅度最小。在6 d處理中，3號品種MDA含量相對于0 d處理增加了5.18μmol·g-1，4號品種相對于0 d處理增加了2μmol·g-1，5號品種相對于0 d處理增加了1.96μmol·g-1。

圖6 人工老化處理下芥藍(lán)種子的可溶性蛋白含量

圖7 人工老化處理下芥藍(lán)種子的MDA含量

2.6 人工老化對芥藍(lán)種子SOD活性的影響

由圖8可看出，3、4、5號品種的SOD活性均隨老化處理時(shí)間的延長表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢。其中3號品種降低趨勢明顯，4號品種次之，5號品種則是緩慢上升。在0 d處理中，3號品種為9.44 U·mg-1，4號品種為10.54 U·mg-1，5號品種為8.40 U·mg-1。在3 d處理中，3號品種增加幅度最小，4號品種增加幅度次之，5號品種增加幅度最大。在6 d處理中，3號品種相對于3 d處理降低了1.15 U·mg-1，4號品種相對于3 d處理降低了0.19 U·mg-1。5號品種繼續(xù)緩慢增加。

2.7 人工老化對芥藍(lán)種子POD活性的影響

由圖9可看出，3、4、5號品種的POD活性均隨老化處理時(shí)間的延長表現(xiàn)出降低的變化趨勢。其中3號品種降低趨勢明顯，4號品種次之，5號品種緩慢下降。在0 d處理中，3號品種POD活性為250 U·(g·min)-1，4號品種為225 U·(g·min)-1，5號品種為262 U·(g·min)-1。在3 d處理中，3號品種POD活性降低幅度最大，4號品種次之，5號品種POD活性降低幅度最小。在6 d處理中，3號品種POD活性相比于0 d處理降低了243.75 U·(g·min)-1，4號品種相對于0 d處理降低了177.08 U·(g·min)-1，5號品種POD活性降低了135.42 U·(g·min)-1。

圖8 人工老化處理下芥藍(lán)種子的SOD活性

圖9 人工老化處理下芥藍(lán)種子的POD活性

3 討 論

隨著人工老化處理時(shí)間的延長，種子內(nèi)部會(huì)發(fā)生物質(zhì)和能量代謝的變化以及生理生化的劣變，這些代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致種子活力進(jìn)一步降低，并直接抑制萌發(fā)[13]。其中，種子生活力是種子潛在發(fā)芽能力的標(biāo)準(zhǔn)之一，并且與種子的發(fā)育、儲藏以及萌發(fā)等生理活性密切相關(guān)。發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)通常用于生產(chǎn)上測定種子的生活力[14]。M.Massimi發(fā)現(xiàn)，在種子加速老化試驗(yàn)后，大粒種子在發(fā)芽中顯著優(yōu)于中小粒種子，表現(xiàn)為小粒種子發(fā)芽率最低[15]。本試驗(yàn)通過對芥藍(lán)種子進(jìn)行高溫高濕老化處理，發(fā)現(xiàn)隨著老化處理時(shí)間的延長，種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率以及種子活力均下降。這與鮮萱等[16]、孫春青等[17]的研究結(jié)果一致。

活性氧(ROS)是通過誘導(dǎo)質(zhì)膜上的過氧化作用而降低膜完整性的重要因素[18]。ROS的積累和自由移動(dòng)以及保護(hù)酶活性的減弱，是引起種子細(xì)胞質(zhì)膜完整性下降的重要因素之一。當(dāng)外部環(huán)境條件合適時(shí)，引起質(zhì)膜完整性降低的因素可能是由磷脂酶和脂氧合酶的活化引起的酶促反應(yīng)。同時(shí)，老化種子的發(fā)芽率顯著下降與膜脂質(zhì)過氧化程度顯著正相關(guān)[13]。蔡春菊等推測，丙二醛將結(jié)合保護(hù)酶，例如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)，這將導(dǎo)致保護(hù)酶的空間構(gòu)象發(fā)生變化，自由基積累和膜脂質(zhì)過氧化[19]。隨著試驗(yàn)中老化處理時(shí)間的延長，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量都呈上升趨勢。這與孫守江等[20]、張海嬌等[21]的研究結(jié)果一致。表明在高溫高濕處理下，ROS破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化程度加快，從而增加了相對電導(dǎo)率和丙二醛含量。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，可溶性糖含量隨著老化處理時(shí)間的延長而降低。彭建等認(rèn)為，種子在高溫環(huán)境或高濕環(huán)境的貯藏過程中，呼吸作用明顯加強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致糖代謝加快[27]。因此，在高溫脅迫下，種子的可溶性糖含量有所下降。而可溶性蛋白含量隨著老化處理時(shí)間的延長而增加。這與成廣雷等[28]和孫春青等[17]的研究結(jié)果相反?？赡苡捎谔幚頃r(shí)間不夠，延長時(shí)間能更明顯地看出兩者之間的相關(guān)關(guān)系。王鶴冰等發(fā)現(xiàn)，芥菜種子可溶性蛋白含量在種子老化2～6 d的時(shí)期，有一個(gè)短暫的回升過程[29]。這可能是種子在老化過程中有不同的水解酶產(chǎn)生，從而合成新的蛋白質(zhì)引起的。

4 結(jié) 論

本研究以5種芥藍(lán)種子為材料，采用40 ℃、100%相對濕度進(jìn)行高溫高濕人工加速老化的處理方法，研究老化對芥藍(lán)種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、種子活力以及生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，隨著老化處理時(shí)間的延長，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和種子活力都有明顯的下降趨勢。且3號品種種子下降幅度最大，5號品種種子下降幅度最小。相對電導(dǎo)率以及MDA含量隨老化處理時(shí)間的延長而增加，表現(xiàn)為3號品種增加幅度最大，5號品種增加幅度最小。SOD活性隨種子老化處理時(shí)間的延長出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，3號品種較5號品種而言清除自由基及過氧化物的能力弱。POD活性隨種子老化處理時(shí)間的延長出現(xiàn)降低的變化趨勢，且5號品種清除自由基及過氧化物的能力較強(qiáng)。可溶性糖含量隨種子老化處理時(shí)間的延長出現(xiàn)降低的變化趨勢，而可溶性蛋白則出現(xiàn)增加的變化趨勢，原因在于老化過程中有不同的水解酶產(chǎn)生，進(jìn)而合成新的蛋白質(zhì)。通過生理層面對老化的芥藍(lán)種子進(jìn)行研究得知種子內(nèi)部是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，逆境的發(fā)生影響了種子活力的表達(dá)。因此，以生理特性作為研究的基礎(chǔ)，利用分子機(jī)制進(jìn)一步研究種子活力關(guān)鍵基因的表達(dá)，以期更充分的掌握種子劣變機(jī)理。