應用頂空-毛細管柱氣相色譜法測定一次性無菌氣管插管環(huán)氧乙烷殘留量的研究

李平 王野 吳永芝

(天津美迪斯醫(yī)療用品有限公司，天津 300385)

氣管插管用于插入患者氣管和（或）支氣管，為患者特別是不能自主呼吸或者手術(shù)中需要呼吸麻醉的患者創(chuàng)建一個臨時性的人工呼吸通道。氣管插管通常頭部有一個或兩個套囊，套囊充起后可以起到固定插管和密封氣道的作用，防止異物進入呼吸道，保持呼吸道通暢，進行有效的人工或機械通氣。插管管身通常由高分子材料制成，管身內(nèi)埋有鋼絲線圈，以提高徑向強度和軸向柔軟度。按照國家藥品監(jiān)督管理局2017年發(fā)布的《醫(yī)療器械分類目錄》，氣管插管歸為“08-06呼吸、麻醉用管路、面罩”中的“03氣管內(nèi)插管/氣管套管”，屬于Ⅱ類醫(yī)療器械，要求無菌提供，一次性使用。

醫(yī)療器械常用的滅菌方式主要干熱、濕熱、環(huán)氧乙烷(Ethylene Oxide,EO)、輻照等。EO氣體及其混合物作為一種有效的滅菌劑，主要用于不能進行濕熱滅菌的醫(yī)療器械，即畏濕、畏熱的醫(yī)療器械[1]。氣管插管多使用PVC等醫(yī)用高分子材料，受其耐受性等因素影響，現(xiàn)廣泛使用EO滅菌。EO作為一種廣譜低溫滅菌劑，其作用原理是烷基化，通過對細胞中DNA、蛋白質(zhì)（酶）等分子的不可逆作用導致分子功能喪失，細胞不再復制，繼而死亡。其大量殘留對人體具有遺傳毒性、生殖毒性、致癌性等問題[2]，因而為了避免對使用者的身體造成傷害，檢測EO殘留量具有重要意義。

國家對經(jīng)EO滅菌的一次性醫(yī)療用品出廠具有嚴格規(guī)定，即EO殘留量不大于10μg/g[3]。EO殘留檢測方法根據(jù)GB/T14233.1-2008[4]有比色分析法和氣相色譜法兩種，而后者檢測具有較強的選擇性，且具有不受被測樣品的成分和性質(zhì)干擾的特點，適合各種材質(zhì)醫(yī)療器械的EO殘留測定[5]。目前，一次性無菌氣管插管多采用填充柱氣相色譜法，手工進樣、柱效低、檢出限較高[6]。本研究采用頂空-毛細管柱氣相色譜法檢測EO，簡單、準確、快速，檢出限低，精密度和準確度良好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

氣相色譜儀：島津氣相色譜儀GC2014C，火焰離子檢測器(FID)；HS-10頂空進樣器；色譜柱：毛細管柱Inert Cap 624，長度×直徑×膜厚=30.0m×0.25mm×1.4μm。

1.2 試藥

1.2.1 標準樣品的配制

EO標準品(o2si smart solutions，上海安譜實驗科技股份有限公司，Lot No.318517&373149)，濃度10000mg/L；稀釋用水為滅菌注射用水（石家莊四藥有限公司）；20ml頂空瓶及丁基頂空瓶蓋。

1.2.2 一次性無菌氣管插管

天津美迪斯醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)，ETT-X32-65，批號：20191213。

1.2.3 樣品制備[7]

一次性無菌氣管插管，主要由帶囊管體、氣源接頭、單向閥或壓力指示器等構(gòu)成。樣品制備選取與人體接觸部分，按照要求采用極限浸提方法中的熱浸提方法。

2 實驗部分

2.1 色譜條件

氣化室溫度120℃，載氣為氮氣，分配比10，流量1.2mL/min，色譜柱溫100 ℃，檢測器溫度160℃。按外標法以峰面積計算EO的含量。

2.2 正交實驗

2.2.1 正交實驗設計

根據(jù)GB/T9722-2006[8]，考慮EO本身的物化性質(zhì)及所選氣相色譜儀的特點等因素，主要選取樣品提取的平衡溫度、平衡時間和攪拌這3個因素。為了選擇出檢測EO的最佳實驗條件，正交設計三水平三因素實驗，采用正交表L9（34）安排實驗，見表1。

表1 正交實驗因素水平

2.2.2 正交實驗結(jié)果及分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表2。從極差可以看出，對峰面積影響的因素主次順序是A →B →C；從方差分析得出A在顯著性水平α=0.10上是顯著的。由此可以確定樣品預處理的方法是頂空瓶平衡溫度為80℃，平衡時間15min，無需攪拌。

3 驗證部分[6,9-10]

按照優(yōu)化實驗參數(shù)，取平衡溫度80℃，平衡時間15min，完成以下實驗。

3.1 線性范圍、回歸方程和檢出限

配制1～20μg/ml共7個濃度的標準溶液，精確量取5ml置于20ml頂空瓶中密封，按上述色譜條件測定峰面積。以EO標準液的濃度（μg/ml）為橫坐標，以對應的峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。

EO濃度在5～100μg線性關系良好，相關系數(shù)為0.9998，回歸方程為Y=8537.28X-2363.41。檢出限按3倍基線噪音計算為0.06μg/ml。

表2 正交實驗L9 (34)結(jié)果數(shù)據(jù)及極差分析、方差分析計算

3.2 專屬性實驗[11]

取未經(jīng)EO滅菌的氣管插管，剪成5mm的碎片，精密稱取1.00g，放入20ml的頂空瓶中加8μg/ml的EO溶液5ml，密封后放入頂空進樣器。用10μg/ml的EO溶液作為對照液，按照上述色譜條件測定，未經(jīng)滅菌的氣管插管如有雜質(zhì)峰，應與EO峰基線分離，分離度R＞1.5。樣品圖譜見圖1、圖2。

由圖1可得，未經(jīng)EO滅菌的樣品圖譜無雜峰出現(xiàn)，與圖2中8μg/mL的EO溶液對照品對比，結(jié)果明顯，符合檢定標準。

圖1 未經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的樣品圖譜

3.3 準確度或回收率實驗

精密稱定EO適量，配制濃度為約4.8μg/mL、9.9μg/mL、19.8μg/mL的EO溶液各3份，分別按上述氣相色譜方法測定，計算回收率，即測得值除以加入量。通過回收率高低判斷準確度。回收率（%）=測得量/加入量×100%。回收率平均值應在90%～110%之間（n ≥9，至少3個濃度，每個濃度3份樣品），相對標準偏差應≤5%（n ≥9，至少3個濃度，每個濃度3份樣品）。EO溶液準確度試驗數(shù)據(jù)見表3。

結(jié)果表明，按照上述色譜條件測定，3個標準樣品的EO平均濃度分別為4.806μg/ml、10.023μg/ml和20.082μg/ml，相對標準偏差分別為0.32%、2.36%和2.14%。符合要求。

圖2 8μg/mL環(huán)氧乙烷溶液圖譜

表3 EO溶液準確度試驗數(shù)據(jù)

3.4 精密度試驗

分別取3個濃度的EO溶液5ml于頂空瓶中，連續(xù)進行6次測定，計算相對標準偏差。由相對標準偏差分析精密度，當≤5%時，表明精密度良好。結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，按照上述色譜條件測定，3個EO的平均濃度分別為2.56μg/ml、5.69μg/ml和11.70μg/ml，相對標準偏差分別為0.74%、1.77%和2.54%，＜5%。該方法的精密度良好。

3.5 樣品EO殘留量試驗

選取樣品中與人體接觸部分進行實驗，將其截為5mm的碎片，精密稱取1.0000g，放入20mL的頂空瓶中精密加水5mL，使樣品充分浸泡在水中，密封后放入頂空進樣器。EO測量結(jié)果按式（1）計算[7]。

上式中，CEO：產(chǎn)品中EO相對含量，μg/g；5：量取的浸提液體積，ml；c：標準曲線上得到的樣品試液相應的濃度，μg/g；m：稱樣量，g。

樣品EO殘留量測定結(jié)果見表5。

4 討論

氣相色譜法相較于比色分析法測試EO，具有機械性高、重復性好等特點，漸漸成為各醫(yī)療器械單位的首選，但也提出了更高的技術(shù)要求。儀器的選擇方面，該實驗沒有選擇頂空手動進樣，因為EO的易揮發(fā)性易造成精密度不高和結(jié)果不準確的情況。本實驗采用頂空自動進樣器，表現(xiàn)出了良好的精密度。另外，色譜柱選擇中多推薦填充柱，但本實驗中考慮到毛細管柱的普及性、使用方便、柱效高、靈敏度高等特點，選擇的毛細管柱Inert Cap 624是中等極性氣相毛細管色譜柱，適合于極性較小的EO。

表5 樣品EO殘留量

在方法學建立方面，氣相色譜檢測過程中其設定的操作參數(shù)較多，不僅僅需要確定檢測參數(shù)，而且需要針對不同的醫(yī)療器械確定不同的前處理參數(shù)，包括平衡時間、平衡溫度、攪拌頻率等。正交實驗是處理多因素實驗中比較常用且較為科學的方法，各個因素之間具有均勻分散和整齊可比的特點。相比較于單因素優(yōu)選法，正交實驗法更具有代表性，容易區(qū)分因素影響的主次順序，用較少的試驗次數(shù)獲得各因素對效應指標的影響，通過數(shù)理統(tǒng)計方法對實驗結(jié)果進行分析，獲取最佳或者較理想的實驗條件或參數(shù)[12]，縮短了樣品檢測周期和條件優(yōu)化時間，更加適合實際應用。本文通過正交試驗建立氣相色譜法測定EO的方法，希望能為其他醫(yī)療器械單位的檢測方法確立提供參考，保證快速、高效、準確地檢測出EO殘留量，確保相關一次性使用無菌醫(yī)療器械的安全性。

此次實驗使用正交實驗的方法，對峰面積進行量化評價，通過極差分析和方差分析計算，最佳水平組合為A3B1C1，即平衡溫度80℃，平衡時間15min，無需攪拌。繼而，根據(jù)選定參數(shù)進行線性試驗、準確度試驗、精密度試驗等，證明該法靈敏度高、精密度和準確度良好，能夠用于一次性無菌氣管插管的EO殘留量檢測。