基于礦質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素的馬鈴薯產(chǎn)地溯源技術(shù)

張欣昕，張福金,，劉廣華，張 堯，王雪嬌，莎 娜，連海飛

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.鄂爾多斯市環(huán)境保護中心監(jiān)測站，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000）

馬鈴薯作為世界十大營養(yǎng)食品之一，可以提供人類生活所必需的基本營養(yǎng)素。它富含淀粉、纖維等碳水化合物和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，并且具有較好的氨基酸組成[1]，幾乎不含游離脂肪和膽固醇[2]，是良好的、廉價的低脂肪食物來源。因此，馬鈴薯又有“能源植物”、“地下蘋果”、“第二面包”等多種美喻[3]。作為內(nèi)蒙古主要作物之一的馬鈴薯，應(yīng)其得天獨厚的天然地理環(huán)境，具有優(yōu)于其他產(chǎn)區(qū)的品質(zhì)特征，是內(nèi)蒙古特色標志性農(nóng)產(chǎn)品之一。

目前，國內(nèi)外基于礦質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素的產(chǎn)地溯源研究眾多：起初多應(yīng)用于植物源性特色農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域，包括葡萄酒[4]、茶葉[5]、水果[6]、小麥[7]、苦蕎[8]、花生[9]、大米[10]、中藥[11]等。例如：Kelly等[12]利用礦質(zhì)元素溯源分析技術(shù)對美國、歐洲、印度和巴基斯坦4 個國家的稻米進行產(chǎn)地鑒別，發(fā)現(xiàn)錳、硼、硒、鉛等元素能作為地域特征的重要指紋信息，是有效的溯源指標；Branch等[13]發(fā)現(xiàn)δ13C能有效區(qū)分加拿大、美國和歐洲不同地域的小麥樣品；馬奕顏[14]探討了礦物元素溯源分析技術(shù)在獼猴桃產(chǎn)地溯源的有效性，建立了獼猴桃產(chǎn)地溯源的有效指標體系及產(chǎn)地判別模型；張遴等[15]采用穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)，對我國陜西、寧夏、山東等11 個省市‘紅富士’蘋果中δ13C進行測定分析，研究發(fā)現(xiàn)‘紅富士’蘋果中δ13C具有區(qū)域獨特性和時間穩(wěn)定性。隨著研究技術(shù)的發(fā)展，其研究領(lǐng)域逐漸擴展到動物性農(nóng)產(chǎn)品中，肉類（牛羊肉[16-17]）、乳類制品[18]等領(lǐng)域的產(chǎn)地溯源也有了相當廣泛的研究。例如Schmidt等[19]對美國和歐洲的牛肉樣品中C和N同位素進行研究，結(jié)果表明C、N同位素比值可作為區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)牛肉的重要指標。

大量研究表明：基于礦質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素的溯源分析技術(shù)在產(chǎn)地溯源上，溯源指標科學，判別正確率、可信度較高，因此，在借鑒前人完善的采樣方法、檢測技術(shù)以及分析手段的基礎(chǔ)上，嘗試利用礦質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素溯源分析技術(shù)，通過對不同產(chǎn)區(qū)馬鈴薯礦質(zhì)元素含量和穩(wěn)定同位素比值的分析討論，開展馬鈴薯產(chǎn)地判別研究，旨在為內(nèi)蒙古馬鈴薯產(chǎn)地判別以及地理標志產(chǎn)品保護提供參考與幫助，以期促進內(nèi)蒙古馬鈴薯區(qū)域品牌的構(gòu)建與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 mm×5 mm錫囊、濃硝酸（優(yōu)級純） 德國Meker公司；內(nèi)標物鈧（Sc）、鍺（Ge）、銦（In）、鉍（Bi）（單元素標準溶液1 000 mg/L） 國家標準物質(zhì)采購中心；尿素IVA33802174（同位素標準品） 德國Analysentechnik GmbH & Co.KG公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MARS 6微波消解系統(tǒng) 美國CEM公司；iCAP-TQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、DELTA V穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（配Flash EA 1112型元素分析儀） 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

在2017年和2018年馬鈴薯收獲期，分別采集內(nèi)蒙古、黑龍江、新疆、四川和廣東5 個省區(qū)馬鈴薯主產(chǎn)縣市馬鈴薯生產(chǎn)基地樣品，共計100 份，采樣地點信息如表1所示。每個采樣點隨機采集3 個樣品。將采集馬鈴薯去皮后，去離子水洗滌，組織搗碎機勻漿后，取50～100 g，于60 ℃鼓風烘箱干燥2 h后，再用105 ℃烘干至恒質(zhì)量[20]，充分研磨后，過100 mm目篩，作為分析樣品備用。

表1 采樣地點統(tǒng)計Table 1 Statistics of sampling locations

1.3.2 樣品分析

礦質(zhì)元素的測定：參考GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》[21]。準確稱取馬鈴薯樣品0.5 g（精確至0.001 g）于微波消解管內(nèi)，加入10 mL濃硝酸，靜置1 h，旋緊管蓋，采取程序升溫法進行樣品消解，待消解結(jié)束后冷卻至室溫，用少量水沖洗內(nèi)蓋，真空趕酸，用去離子水定容至50 mL容量瓶內(nèi)，同時做空白實驗。用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定樣品中的鈉、鎂、鋁、鉀、鈣、鐵、硼、磷、釩、鉻、錳、鈷、鎳、銅、鋅、砷、硒、鎘共18 種礦物元素的含量。用外標法定量分析，用環(huán)境標樣為標準品，用Sc、Ge、In、Bi保證儀器穩(wěn)定性。電感耦合等離子體質(zhì)譜運行條件如表2所示。

表2 電感耦合等離子體質(zhì)譜運行條件Table 2ICP-MS operating conditions

穩(wěn)定同位素的測定：參照張協(xié)光等[22]的方法。稱取制備好的樣品0.5～1.0 mg包入錫囊，排盡空氣，放入元素分析儀的固體進樣器依次進樣，樣品在960 ℃條件下燃燒生成CO2和N2，經(jīng)稀釋儀稀釋后進入質(zhì)譜進行檢測。

元素分析儀測定：氦氣吹掃流量100 mL/min，參考氣流速90 mL/min，氣相柱溫度70 ℃。

質(zhì)譜條件：真空度6.0×10-6mbar，電離電壓3.0 kV，CO2參考氣壓0.6 bar，N2參考氣壓1.0 bar。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于礦質(zhì)元素的產(chǎn)地鑒別

2.1.1 礦質(zhì)元素含量差異分析

表3 不同地區(qū)礦質(zhì)元素含量Table 3 Mineral elements contents in potato samples collected from different producing regions mg/kg

表4 方差分析結(jié)果統(tǒng)計Table 4 Analysis of variance

如表3、4所示，砷和硒的P值分別為0.07和0.095 7，在0.05水平上差異不顯著，其他16 種元素含量差異顯著（P＜0.05），說明馬鈴薯中不同礦物元素在不同地區(qū)的含量存在顯著性差異。

2.1.2 礦質(zhì)元素含量主成分分析

表5 礦質(zhì)元素的主成分貢獻率Table 5 Contribution rates of principal components for mineral elements

主成分分析是一種將多變量通過降維，找出數(shù)據(jù)群體主要影響因子的多元統(tǒng)計分析方法[23]。如表5所示，選取特征值大于1的成分作為主成分，提取5 個有效主成分。第1主成分貢獻率為33.747%，第2主成分貢獻率為15.243%，第3主成分貢獻率為9.344%，第4主成分貢獻率為6.248%，第5主成分貢獻率為5.973%，總貢獻率達到了70.557%，5 個主成分基本包括了不同元素含量和組成的大部分信息，可充分反映原始數(shù)據(jù)大量信息。

根據(jù)元素的載荷大小逐步對元素進行篩選，參照鹿保鑫[24]的方法。選擇第1主成分和第2主成分的因子載荷值作圖，如圖1A所示，橫坐標代表第1主成分載荷值，縱坐標代表第2主成分載荷值，成分因子載荷值的絕對值取值越大，代表元素的方差貢獻率越大，即硼、磷、錳、鉻、銅、鋅元素載荷值均在0.8左右，在第1主成分上載荷值較大，6 個元素基本可以反映第1主成分的信息；鎂、鈉、鉀、鋁元素載荷值的絕對值在0.6～0.7之間，在第2主成分上載荷值較大，這4 個元素基本可以反映第2主成分的信息，說明硼、磷、錳、鉻、銅、鋅、鎂、鈉、鉀、鋁等元素，攜帶足夠的區(qū)域特征信息，在很大程度上可以作為馬鈴薯產(chǎn)地溯源的特征礦質(zhì)元素。利用第1主成分和第2主成分的因子得分繪制散點圖，如圖1B所示，內(nèi)蒙古和新疆、四川、廣東、黑龍江5 地樣品基本得到有效區(qū)分，內(nèi)蒙古本地樣品間也存在距離間隔，說明礦質(zhì)元素可作為馬鈴薯產(chǎn)地鑒別的指標，在內(nèi)蒙古本地樣品間的產(chǎn)地鑒別上也同樣具有應(yīng)用的可能性。

圖1 不同地區(qū)主成分因子載荷圖（A）和得分圖（B）Fig.1 Loading plot (A) and score plot (B) of PCA for potato samples collected from different producing regions

2.1.3 礦質(zhì)元素含量判別分析

判別分析是按照一定分類條件，建立判別函數(shù)，進行數(shù)據(jù)樣本分類的統(tǒng)計方法[25]。18 種礦物元素作為分析指標，利用Fisher函數(shù)，對不同產(chǎn)地馬鈴薯進行了整體判別。表6分類結(jié)果顯示：18 種礦質(zhì)元素初始的整體判別率為98.4%，廣東和新疆的馬鈴薯樣品100%被正確識別，內(nèi)蒙古、四川和黑龍江存在錯判樣品，數(shù)量分別為1、3 份和2 份，內(nèi)蒙古、四川和黑龍江產(chǎn)地馬鈴薯樣品判別率分別為99.4%、85.7%和90.0%。

并利用Leave-One-Out Cross Validation交叉驗證對判別結(jié)果進行驗證。交叉驗證分組案例中，有94.2%的馬鈴薯樣本被正確分類，其中四川、黑龍江和新疆的馬鈴薯樣本正確判別率分別為71.4%、50.0%和81.8%，低于整體水平。

表6 不同地區(qū)礦質(zhì)元素的判別分析分類結(jié)果Table 6 Discriminant analysis of mineral elements in potato samples collected from different producing regions%

在實際產(chǎn)地判別中，不可能同時測定18 種礦質(zhì)元素，時間成本和經(jīng)濟成本較高。為了提高實際應(yīng)用的效率，需要進一步篩選有效信息，減少變量，通過改變變量的處理方式，利用逐步判別對不同地區(qū)馬鈴薯樣品進行產(chǎn)地溯源。分析結(jié)果顯示，在0.01顯著水平下，有8 種元素進入判別模型，8 種元素分別為鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘，回代檢驗結(jié)果顯示8 種元素交叉驗證的正確判別率為89.3%，判別率略低于18 種元素的判別效果，但實際效率相對較高，由鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘8 種元素所建立的判別函數(shù)系數(shù)如表7所示。

表7 判別式分類函數(shù)系數(shù)Table 7 Discriminant classification function coefficients

研究發(fā)現(xiàn)，主成分分析和判別分析方法都能對內(nèi)蒙古、新疆、四川、廣東、黑龍江5 地的馬鈴薯樣品進行準確鑒別，2 種方法均證明鈉、鋁、磷、錳和銅元素在馬鈴薯產(chǎn)地溯源中具有良好的產(chǎn)地指紋特征，但判別正確率未達到95%以上。

2.2 基于同位素比值的產(chǎn)地鑒別

2.2.1 同位素比值差異

表8 不同地區(qū)δ13C和δ15N值Table 8 δ13C and δ15N values of potato samples collected from different producing regions

如表8所示，不同地區(qū)的δ13C值范圍在-22.47‰～-38.55‰之間，δ15N值的范圍在-1.91‰～3.08‰之間，內(nèi)蒙古與黑龍江、新疆、廣東的δ13C值和δ15N值分別存在顯著性差異（P＜0.05），說明內(nèi)蒙古馬鈴薯中的δ13C值和δ15N值與其他地區(qū)間有明顯的分離趨勢。

研究表明[26]：同一物種的δ13C值差異受生長地的氣候環(huán)境（如溫度、海拔、降水等）的影響，而δ15N組成受植物類型、化學肥料、氣候條件、土壤狀況等因素的影響。劉賢趙等[27]研究年降水400 mm等值線上自東北向西南沿途采集的28 個科118 種239 份C3植物樣品，發(fā)現(xiàn)所有樣本δ13C與溫度之間呈極顯著線性正相關(guān)（P＜0.000 1），隨年均溫度和夏季平均溫度的增加，植物碳同位素均呈偏正的趨勢；李嘉竹等[28]研究發(fā)現(xiàn)2 000 m以上高海拔區(qū)323 個C3植物樣品δ13C值與海拔高度存在極顯著的線性正相關(guān)（r=0.496，P＜0.000 1）；而2 000 m以下低海拔地區(qū)C3植物δ13C值與海拔呈負相關(guān)，與溫度呈正相關(guān)。高登義等[29]也有相似的研究結(jié)果。另外，植物的水分利用也是影響δ13C值的關(guān)鍵因素，任書杰等[30]研究發(fā)現(xiàn)隨水分利用率的下降，δ13C值顯著升高，二者間表現(xiàn)出極顯著負相關(guān)。這些研究結(jié)果與本實驗的δ13C值和δ15N值在一定程度上具有一致性的規(guī)律。

另外，采樣調(diào)研顯示：北方的黑龍江和內(nèi)蒙古馬鈴薯生產(chǎn)均采用規(guī)?；瘒姽嗪偷喂喾绞剑嗨渥?；南方馬鈴薯生產(chǎn)基本集中在山坡地區(qū)，以小農(nóng)戶生產(chǎn)方式為主，基本不具備灌水設(shè)備。新疆的馬鈴薯生產(chǎn)主要集中在農(nóng)牧交錯帶，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)多采用放牧與種植作物混合經(jīng)營，因此δ15N值較高，這與Suzuki等[31]的研究一致，該研究發(fā)現(xiàn)新南威爾士州大米具有更高δ15N值（9.0‰），明顯區(qū)別于加利福尼亞（3.2‰）和日本大米（0.4‰～6.1‰）。

因此，以δ13C值為橫坐標，δ15N值為縱坐標作二維投射圖，如圖2所示，內(nèi)蒙古樣品與黑龍江、新疆、廣東和四川樣品基本可以成功區(qū)分，說明這5 地的δ13C值和δ15N值的組成差異較大，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 不同地區(qū)的δ13C值和δ15N值Fig.2 δ13C versus δ15N plot for potato samples collected fromdifferent producing regions

2.2.2 同位素比值的聚類分析

聚類分析是將數(shù)據(jù)中具有相似性的數(shù)據(jù)進行歸類劃分的統(tǒng)計方法[32]。對不同地區(qū)樣品中的δ13C值和δ15N值進行聚類分析，采用Ward聚類方法計算歐氏距離，產(chǎn)生聚類分析樹狀圖，結(jié)果如圖3所示。以最小分類級別（1.7）為分割線，所有樣品可以分為10 類，其中內(nèi)蒙古與黑龍江、新疆和廣東距離較遠，被完全分離，其δ13C值和δ15N值的組成差異較大，內(nèi)蒙古與四川樣品存在交叉現(xiàn)象、黑龍江和新疆樣品存在交叉現(xiàn)象。同時也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古本地區(qū)樣品也被劃分為5 類，內(nèi)蒙古不同地區(qū)在其δ13C值和δ15N值的組成上也存在較大差異，證明了δ13C值和δ15N值的組成也可應(yīng)用于內(nèi)蒙古不同馬鈴薯產(chǎn)地的鑒別研究。

圖3 不同地區(qū)的δ13C值和δ15N值聚類分析Fig.3 Cluster analysis of potato samples collected from different producing regions based on δ13C and δ15N

2.2.3 同位素比值的判別分析

為了將δ13C值和δ15N值轉(zhuǎn)化為可通過函數(shù)計算，并能獲得產(chǎn)地判別精度，再一次應(yīng)用判別分析的方法對不同地區(qū)的δ13C值和δ15N值進行分析。利用Fisher函數(shù)，獲得5 個判別函數(shù)，利用判別函數(shù)進行不同產(chǎn)地樣品判別，如表9所示。初始判別率為82.0%，其中內(nèi)蒙古和黑龍江的產(chǎn)地初始判別準確率分別為82.6%和77.8%，低于平均水平，可能需要利用礦質(zhì)元素的指紋特性進一步提升產(chǎn)地鑒別的精度。

表9 不同地區(qū)判別分析分類結(jié)果Table 9 Discriminant analysis of potato samples collected from different producing regions based on δ13C and δ15N%

2.3 基于礦質(zhì)元素和同位素比值的產(chǎn)地判別

針對8 種礦質(zhì)元素含量和同位素比值分別在產(chǎn)地判別正確率均未達到95%以上的問題，進一步研究2 種方法相結(jié)合的產(chǎn)地判別方法。

基于鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘、δ13C和δ15N值，再次對內(nèi)蒙古與黑龍江、新疆、四川和廣東不同產(chǎn)地馬鈴薯進行產(chǎn)地判別，結(jié)果如表10所示。在礦質(zhì)元素含量和同位素比值綜合指標下，對初始分組案例中94.7%進行正確分類，即不同產(chǎn)地的初始判別正確率為94.7%，對交叉驗證分組案例中93.2%進行了正確分類，即不同產(chǎn)地的交叉驗證正確率達93.2%，高于礦質(zhì)元素含量和同位素比值單獨判別正確率，判別結(jié)果良好。

表10 基于礦質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素的不同地區(qū)判別分析分類結(jié)果Table 10 Discriminant analysis of potato samples collected from different producing regions based on mineral elements and stable isotopes%

3 結(jié) 論

本研究分別對內(nèi)蒙古與黑龍江、新疆、四川和廣東不同產(chǎn)地馬鈴薯樣品進行礦質(zhì)元素含量和組成、碳和氮同位素比值進行測定。采用步進式方法篩選出鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘8 種礦質(zhì)指紋指標，回代檢驗結(jié)果顯示這8 種元素的交叉驗證的正確判別率為89.3%；不同地區(qū)的δ13C值和δ15N值存在顯著性差異，內(nèi)蒙古樣品與黑龍江、新疆、廣東樣品基本可以成功區(qū)分，采用δ13C和δ15N建立的產(chǎn)地判別模型的判別正確率為82.0%；在鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘、δ13C和δ15N的綜合指標下，不同產(chǎn)地的初始判別正確率達94.7%，不同產(chǎn)地的交叉驗證正確率達93.2%，高于礦質(zhì)元素含量和同位素比值單獨判別正確率，判別結(jié)果良好。結(jié)果證明利用礦物元素和穩(wěn)定同位素相結(jié)合的技術(shù)可以對馬鈴薯進行有效的產(chǎn)地判別，判別正確率較高，是產(chǎn)地溯源的有效方法。