通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕對產后抑郁癥模型大鼠下丘腦-垂體-性腺軸的影響*

吳曉玲，張貴鋒△，李力強，曾統(tǒng)軍，祝曉忠

(1.肇慶醫(yī)學高等?？茖W校，廣東 肇慶 526020；2.南方醫(yī)科大學附屬順德醫(yī)院，廣東 佛山 528300；3.肇慶市中醫(yī)院,廣東 肇慶 526020)

產后抑郁癥(Postpartum depression，PPD)是臨床一種常見的繼發(fā)性抑郁癥，一般在孕婦產后2周左右開始出現(xiàn)癥狀，4～6周癥狀加重，可持續(xù)3～6個月。研究發(fā)現(xiàn)國內產后抑郁癥發(fā)生率為13.1%～16.3%。本病不僅會嚴重危害到產婦的身心健康和家庭和諧，嚴重的甚至會出現(xiàn)自殺和殺嬰行為，而且對嬰兒生長發(fā)育、心理等有不良影響[1]。由于產后處于哺乳期，患者及其家屬往往會顧慮藥物對嬰兒的影響，治療依從性較差。臨床觀察和文獻分析表明，針灸治療產后抑郁癥安全有效[2]。筆者課題組觀察了運用通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕治療產后抑郁癥的臨床治療效果，發(fā)現(xiàn)能顯著改善患者的臨床癥狀[3]，但療效機制尚不完全明確。已有研究證實抑郁癥患者的下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)活性下降[4]；產后抑郁癥屬于繼發(fā)性抑郁癥范疇，有研究認為產后抑郁癥患者的性激素水平紊亂[5]。因此，筆者課題組認為通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕干預產后抑郁癥的療效可能與調控HPGA活性有關，通過觀察該療法對產后抑郁癥模型大鼠HPGA相關激素水平的影響，探索其療效作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康雌性SD大鼠(南方醫(yī)科大學實驗動物中心,生產許可證號:SYXK<粵>2016-0041)120只，3月齡，體質量(200±20)g。在實驗過程中，大鼠自由攝食和飲水，術前禁食。飼養(yǎng)環(huán)境維持在20～22℃之間，相對濕度保持在60%～80%之間，12 h光照和12 h黑夜循環(huán)。

1.2 藥品和試劑

1.2.1 藥品 黃體酮注射液(批號:160803，廣州白云山明興制藥有限公司)，苯甲酸雌二醇注射液(批號:160711，廣州白云山明興制藥有限公司)；鹽酸氟西汀膠囊(批號:4407A，禮來蘇州制藥有限公司)，每次灌胃前溶于蒸餾水配置成濃度為0.25 mg/mL的藥液。黃芪20 g、皂角(煨)10 g、藿香15 g、石菖蒲15 g、干姜5 g、小茴香15 g、肉桂5 g、雄黃2 g、丁香10 g、蘇合香5 g(肇慶醫(yī)學高等?？茖W校附屬醫(yī)院中藥房采購)，粗鹽100 g(網絡購物平臺采購)，干燥以后粉碎，過80目篩，炒制成藥鹽備用。

1.2.2 試劑 黃體生成素(Luteinising Hormone，LH)、雌二醇(Estradiol，E2)、卵泡刺激素(Follicle-stimulating Hormone，F(xiàn)SH)、孕酮(Progesterone，P)RIA檢測試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?；促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)ELISA檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。

1.3 儀器和器材

DFM-96型放射免疫γ計數(shù)器(合肥眾成機電技術開發(fā)有限責任公司);DNM-9602G酶聯(lián)免疫檢測儀(北京普朗新技術有限公司)；針灸毫針(規(guī)格:0.30 mm×40 mm、0.30 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療器械廠有限公司);艾絨(李時珍蘄艾，湖北蘄春艾之寶制品有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠分組

全部大鼠適應性飼養(yǎng)1周，根據(jù)曠場(Open-Field)實驗評分結果，篩選出合格大鼠120只，采用隨機數(shù)字表法隨機分為空白組20只、假手術組20只、造模組80只。造模組大鼠在確認造模成功后，再隨機分為模型組、藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組，每組20只。在干預后的第2周末、第4周末設兩個指標檢測時間點，各組大鼠在每個時間點采用隨機數(shù)字表法隨機選取10只進行相關指標檢測。

2.2 大鼠造模

造模組80只大鼠參照Galea報道的方法[6-7]進行造模。對大鼠行腹腔注射麻醉后左側位固定在手術臺上，在其脊柱旁開1橫指、肋緣后1橫指的部位進行備皮和消毒。先從大鼠腰椎沿背部正中線向下縱向切開1 cm左右的口子，將雙側子宮角拉出體腔外，再在卵巢下方、子宮連接處兩個部位分別進行結扎，然后摘除大鼠的雙側卵巢，完成手術后將子宮體送回腹腔內縫合好，消毒切口部位并涂慶大霉素預防感染。假手術組大鼠的手術操作步驟同上，不同的是，不摘除大鼠的雙側卵巢，僅摘取卵巢周圍的少量脂肪組織，盡量保護好卵巢?？瞻捉M不予任何干預處理。采用超快速改良巴氏染色法，對摘除卵巢后的大鼠做陰道細胞學涂片檢測，每日檢測1次，連續(xù)7 d，對于激素水平在逐漸恢復的大鼠剔除不用。選擇陰道細胞學涂片檢測合格的大鼠，采用注射激素的方法模擬大鼠妊娠狀態(tài)下的激素分泌水平，每天定時皮下注射黃體酮4 mg、苯甲酸雌二醇0.1 mg，連續(xù)注射16 d；從第17天起，每天皮下注射苯甲酸雌二醇0.2 mg，連續(xù)注射7 d。在第24天停止注射雌激素?？瞻捉M、假手術組大鼠皮下注射植物油，每日1次，前16 d每次0.3 mL，后7 d每次0.1 mL。

2.3 各組大鼠干預方法

2.3.1 藥物組 鹽酸氟西汀膠囊藥液以1 mL/100 g體質量灌胃。

2.3.2 空白組、假手術組、模型組 與藥物組大鼠等容量的蒸餾水灌胃。

2.3.3 常規(guī)針刺組 局部常規(guī)消毒，用0.25 mm×13 mm針灸針針刺大鼠百會穴、太沖穴，刺至一定深度后均勻捻轉30 s，接電針儀(G6805-Ⅰ型)，連續(xù)波，頻率15 Hz，強度1 mA，以大鼠安靜耐受為度，每次針刺20 min。

2.3.4 實驗組 常規(guī)消毒后用0.25 mm×13 mm針灸針針刺大鼠百會穴、大椎穴、氣海穴、關元穴，刺至一定的深度后均勻捻轉30 s，接電針儀(G6805-Ⅰ型)，連續(xù)波，頻率15 Hz，強度1 mA，以大鼠安靜耐受為度，每次20 min；實驗組大鼠在完成電針治療后隨即進行隔藥鹽灸，將大鼠神闕穴周圍毛剪干凈，將配置好的藥鹽用蒸餾水濕潤后均勻鋪在大鼠神闕穴的部位，然后再將小型艾炷放在藥鹽上施灸，灸3壯，大約20 min，每日治療1次[8]。大鼠取穴參照《實驗針灸學》[9]。

各組大鼠在干預開始后的第2周末、第4周末兩個時間點進行標本采集，每次10只，先進行曠場實驗，然后再處死取材。在處死之前，各組大鼠對應的干預措施均持續(xù)實施。

2.4 指標檢測

2.4.1 曠場實驗 以雙后肢跨出方格為標準，大鼠穿越方格數(shù)作為水平活動評分；以雙前肢離地1 cm為1次記分標準，直立次數(shù)作為垂直活動評分。測試全程保持室內安靜，每只大鼠測試1次，每次觀察5 min，記錄大鼠水平活動與垂直活動評分。每完成1只大鼠測試擦凈紙箱后再放入下一只大鼠。

2.4.2 HPGA相關血清生化指標檢測 血清GnRH采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測，血清FSH、LH、E2、P采用放射免疫法(RIA)檢測。各項血清指標檢測方法均嚴格按照試劑盒的說明書進行操作。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 曠場測試結果

3.1.1 各組水平活動評分比較 在干預后的第2周、第4周，假手術組大鼠評分與空白組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，模型組、藥物組、常規(guī)針刺組大鼠評分低于空白組(P<0.05)；實驗組大鼠第2周評分顯著低于空白組(P<0.05)，而第4周與空白組差異無統(tǒng)計學意義。第2周、4周藥物組、實驗組大鼠評分顯著高于模型組(P<0.05)，第4周常規(guī)針刺組大鼠評分顯著高于模型組(P<0.05)。干預4周后，實驗組大鼠評分顯著高于常規(guī)針刺組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠干預后第2周、第4周曠場實驗水平活動評分比較

3.1.2 各組垂直活動評分比較 在干預后的第2周、第4周，假手術組大鼠評分與空白組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組大鼠評分顯著低于空白組(P<0.05)，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠評分顯著高于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠干預后第2周、第4周曠場實驗垂直活動評分比較

3.2 HPGA相關血清生化指標檢測

3.2.1 各組大鼠不同時間點血清GnRH比較 在干預后第2周、第4周，空白組、假手術組大鼠血清GnRH水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清GnRH水平顯著高于模型組(P<0.05)；第2周，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清GnRH水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且均顯著低于空白組(P<0.05)；第4周，實驗組大鼠血清GnRH水平與空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但顯著高于藥物組、常規(guī)針刺組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠干預后第2周、第4周血清GnRH變化

3.2.2 各組大鼠不同時間點血清LH比較 干預后第2周、第4周，空白組、假手術組大鼠血清LH水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清LH水平顯著低于模型組(P<0.05)；第2周，常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清LH水平顯著高于空白組(P<0.05)，藥物組大鼠血清LH水平與空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第4周，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組、空白組大鼠血清LH水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠干預后第2周、第4周血清LH變化

3.2.3 各組大鼠不同時間點血清FSH比較 干預后第2周、第4周，空白組、假手術組大鼠血清FSH水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清FSH水平顯著低于模型組(P<0.05)；第2周，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清FSH水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但均顯著高于空白組(P<0.05)；第4周，實驗組、藥物組大鼠血清FSH水平與空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但顯著低于常規(guī)針刺組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠干預后第2周、第4周血清FSH變化

3.2.4 各組大鼠不同時間點血清E2比較 干預后第2周、第4周，空白組、假手術組大鼠血清E2水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清E2水平顯著高于模型組(P<0.05)；第2周，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清E2水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，顯著低于空白組(P<0.05)；第4周，實驗組大鼠血清E2水平與空白組差異無統(tǒng)計學意義，顯著高于藥物組、常規(guī)針刺組(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠干預后第2周、第4周血清E2變化

3.2.5 各組大鼠不同時間點血清P比較 干預后第2周、第4周，空白組、假手術組大鼠血清P水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清P水平顯著低于模型組(P<0.05)；第2周，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清P水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清P水平顯著高于空白組(P<0.05)；第4周,藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組、空白組大鼠血清P水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表7。

表7 各組大鼠干預后第2周、第4周血清P變化

4 討論

產后抑郁癥動物模型的抑郁癥狀評價一般沿用抑郁癥動物模型的相關方法，目前公認的有曠場實驗、糖水消耗實驗、強迫游泳實驗等行為學評價方法，研究表明正常大鼠曠場實驗水平及垂直活動均有較高評分[10]。在本研究中，與空白組比較，造模組大鼠曠場實驗的水平評分、垂直活動評分顯著降低，假手術組無顯著差異，提示造模成功。經過2～4周的干預以后，與模型組比較，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠曠場實驗的水平評分、垂直活動評分顯著提高，表明3種干預方法均能有效改善產后抑郁癥模型大鼠的抑郁癥狀。

HPGA軸分泌的激素包括下丘腦分泌的GnRH、LH、FSH以及性腺分泌的E2、P等等。已有研究表明，抑郁癥患者HPGA軸功能紊亂，主要表現(xiàn)為 HPGA 活性下降[11]。李麗麗等[12]發(fā)現(xiàn)中藥復方能夠改善圍絕經期抑郁癥模型大鼠活動度降低情況，同時抑制血清FSH、LH的過渡分泌，使E2保持接近正常生理水平，認為中藥復方是通過調控HPGA軸產生抗產后抑郁癥作用。Ciechanowska M等發(fā)現(xiàn)，急慢性心理應激狀態(tài)下丘腦GnRH及GnRH受體mRNA水平顯著下降[13]。吳萍等[14]發(fā)現(xiàn)，圍絕經期抑郁癥女性FSH和LH顯著高于圍絕經期無抑郁癥女性和正常育齡期女性，E2濃度顯著低于圍絕經期無抑郁癥女性和正常育齡期女性。高鵬等[15]發(fā)現(xiàn)產后抑郁癥婦女血中P水平較無產后抑郁癥婦女高，認為產后體內激素水平的急劇變化可能是產后抑郁癥發(fā)生的生物學基礎。

在本研究中，模型組大鼠血清GnRH、E2水平顯著低于空白組，LH、FSH、P水平顯著高于空白組，這與相關研究結果一致[12-15]，提示產后抑郁癥可能與HPGA軸相關激素血清GnRH、LH、FSH、E2、P的代謝紊亂關系密切。經過2～4周的干預后，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清GnRH、E2水平顯著高于模型組，血清LH、FSH、P水平顯著低于模型組，表明鹽酸氟西汀、電針百會穴及太沖穴、通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕穴都可以調控產后抑郁癥模型大鼠HPGA軸相關激素。干預后第2周，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清GnRH、FSH、E2、P水平無顯著差異，與模型組、空白組比較差異均有統(tǒng)計學意義，表明經過2周的干預治療，產后抑郁癥模型大鼠激素水平趨向恢復正常，但尚不能恢復到正常水平，3種干預方法作用效果相當。干預后第4周，實驗組大鼠血清GnRH、LH、FSH、E2、P水平與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕穴能將產后抑郁癥模型大鼠紊亂的激素水平調控至正常水平范圍內；實驗組大鼠血清GnRH、E2水平與藥物組比較差異無統(tǒng)計學意義，實驗組大鼠血清GnRH、FSH、E2水平與常規(guī)針刺組比較差異有統(tǒng)計學意義，提示通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕穴對產后抑郁癥模型大鼠激素水平的調控效果要優(yōu)于鹽酸氟西汀、電針百會穴和太沖穴，但需要較長的治療時間。

產后抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”“臟躁”等范疇，《婦人大全良方》曰:“產后氣血大傷，心神易浮，不耐驚恐憂悲”，因此本病主要是產后精血虧虛、氣血失和、陰陽失調、五臟失于濡養(yǎng)乃至五志之火內動擾亂神明所致?！巴ㄔ樂ā笔菑V東省名中醫(yī)、全國老中醫(yī)藥專家學術經驗繼承工作指導老師賴新生教授創(chuàng)立的一種新型針刺方法，全稱為“通督養(yǎng)神、引氣歸元針法”，賴新生教授認為，臟腑經絡之氣陰陽相應、腹背之氣交互貫通，針刺治療應當調氣，而調氣的關鍵在于引氣歸元?！瓣幉≈侮?、陽病治陰”，陰病當取在陽之背俞穴，陽病當取在陰之腹募穴，如果二者兼而取之，則達到陰陽二氣貫通歸元的作用，實現(xiàn)陰平陽秘[16]。臨床研究表明，通元針法治療產后抑郁癥、抑郁性神經癥療效顯著[3,17]?！蹲C治匯補·郁證》曰:“郁病雖多，皆因氣不周流，法當順氣為先?！比蚊}為陰脈之海，督脈為陽脈之海，是調節(jié)全身氣血陰陽的關鍵，筆者課題組選取督脈的百會、大椎兩穴通督養(yǎng)神，選擇任脈的氣海、關元兩穴引氣歸元，四穴共同發(fā)揮調和氣血、燮理陰陽的作用。神闕穴與任脈、督脈、沖脈關系密切，沖脈、任脈、督脈一源三岐、同出胞中，研究表明神闕穴隔鹽灸對婦科疾病有良好療效[18]。為了加強灸神闕的效果，在藥鹽中以藿香和石菖蒲芳香化濁、行氣疏肝，以干姜、肉桂、丁香和小茴香溫補脾腎、疏通經絡，以煨皂角和蘇合香通絡開竅、通閉醒腦，以雄黃和黃芪溫陽化氣。運用藥鹽灸神闕穴，能夠同時發(fā)揮了灸療、藥療、臍療的多重作用，整體上達到溫陽補氣、培腎固本的作用。此外，婦人產后多瘀多虛，隔藥鹽灸神闕穴既能芳香行氣、活血通絡，又能補脾益腎、補而不滯、調暢氣血，有助于產后諸癥的康復。

綜上所述，鹽酸氟西汀、常規(guī)針刺、通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕穴3種治療方法都能有效改善產后抑郁癥模型大鼠的抑郁癥狀，對大鼠血清GnRH、LH、FSH、E2、P有顯著調控作用，但是通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕穴的效果更明顯，推測本法治療產后抑郁癥可能與調控HPGA軸相關激素水平相關。由于產后抑郁癥患者血清激素水平變化并不完全一致，相關研究的指標結果甚至相反，需要進一步優(yōu)化檢測指標。