沙宗閣,楊欣,楊長福,黃高,鄭子安,劉楊,任勇
(貴州中醫(yī)藥大學,貴州 貴陽 550025)
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,已成為腫瘤相關(guān)病死率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌最主要的病理類型為腺癌、鱗癌和小細胞癌,根據(jù)組織學特性臨床中將肺癌分為非小細胞肺癌(NSCLC)以及小細胞肺癌(SCLC)兩大類型。其中NSCLC可分為腺癌、鱗狀細胞癌以及大細胞癌[2]。SCLC由于其神經(jīng)內(nèi)分泌特性可以被清楚地鑒別出來,除形態(tài)學以及組織學以外,根據(jù)生長速度以及遠處轉(zhuǎn)移的難易程度特性又將小細胞肺癌分為局限性疾病以及廣泛性疾病。
斑蝥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其味辛,性熱,有大毒。歸肝、胃、腎經(jīng)。功可破血散結(jié)、攻毒蝕瘡[3-4]?,F(xiàn)代藥理研究報道,斑蝥具有抗癌活性,對惡性腫瘤尤其是晚期癌癥有較好的治療效果,如治療胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌等[5-6],但是其毒性限制了在臨床的廣泛應用。斑蝥中有效抗癌成分是斑蝥素,其在抑制腫瘤細胞的同時對機體沒有明顯的免疫抑制作用,這是抗癌藥物中突出的特點[7],對肺癌、乳腺癌等有一定效果[8]。斑螯素可以抑制癌細胞中的DNA、RNA合成,通過干擾DNA的復制及mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程,進而影響細胞的分裂與蛋白質(zhì)的合成,最終抑制癌細胞的生長、分裂[9-10]。為了進一步探討斑蝥素在小細胞肺癌中的作用,本研究采用網(wǎng)絡藥理方法,篩選化學成分-疾病靶點,對其靶點進行生物信息學分析,采用分子對接驗證分析,進一步明確斑蝥素抗小細胞肺癌的分子機制。
GeneMANIA (http://genemania.org/);DAVID(https://david.ncifcrf.gov/);Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/);GeneCards(https://www.genecards.org/)。STRING (https://string-db.org/cgi/input.pl);RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb )。
斑蝥素基于Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行靶點篩選,種屬選擇“人源”,其他參數(shù)默認,篩選結(jié)果包括蛋白名稱、Uniprot ID等信息。
基于GeneCards(https://www.genecards.org/) 和CTD(https://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫篩選小細胞肺癌靶點,以“Small Cell Lung Carcinoma”為關(guān)鍵詞進行篩選,選擇Relevance score≥25為小細胞肺癌的關(guān)鍵靶點。
基于快速預測蛋白功能軟件GeneMANIA (http://genemania.org/)對24個靶點進行富集分析,該數(shù)據(jù)庫可基于共定位(co-localization)、共表達(co-expression)、物理相關(guān)性占(Physical Interactions)、預測(Predicted)、蛋白結(jié)構(gòu)域(Shated protein domains)、遺傳相關(guān)性(Genetic Interactions)等對基因集進行分析和預測。輸入24個靶蛋白的Gene id的,種屬選擇“人源”,其他參數(shù)默認。
STRING(https://string-db.org/)結(jié)合Cytoscape通過degree 篩選關(guān)鍵靶點,選擇輸入方式是“Multiple proteins”,輸入小細胞肺癌靶點24個,種屬選擇“人源”,其他參數(shù)默認[11]。點擊“Exports”選項,下載TSV格式的文件保存,導入Cytoscape軟件,選擇cytoHubba模塊,根據(jù)degree輸出前三個關(guān)鍵靶點[12]。
斑蝥素與3個靶標蛋白分子對接基于iGEMDOCK軟件,靶標蛋白EGFR (PDBID:1M17),PTGS2(PDBID:3W15)和(PDBID:4G8A)從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb)獲取3D晶體結(jié)構(gòu)[13],分子對接相關(guān)參數(shù)參數(shù):解的個數(shù)(number of solution)2,子代 (Generation)70。群體大小(generic evolutionary method)200[13]。
基于CTD和Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選小細胞肺癌,選擇Relevance score≥25為關(guān)鍵靶點,基于CTD獲得1 788個小細胞肺癌靶點,基于Genecards獲得1 077個小細胞肺癌靶點,通過FunRich軟件取交集,共獲得小細胞肺癌靶點673個(圖1 A)。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出斑蝥素化學成分靶點100個(圖1B),采用FunRich 取交集篩選出24個靶點(圖1B)。斑蝥素-小細胞肺癌共有靶點見表1。
注:A:小細胞肺癌靶點;B:化學成分-小細胞肺癌共有靶點。圖1 化學成分-疾病靶點
表1 斑蝥素-小細胞肺癌共有靶點
24個靶點基于GeneMANIA分析靶蛋白的相互作用,其中共定位(co-localization)占0.98%、共表達(co-expression)占35.49%、物理相關(guān)性(Physical Interactions)占34.86%、預測(Predicted)占20.20%、蛋白結(jié)構(gòu)域(Shated protein domains)占4.65%、遺傳相關(guān)性(Genetic Interactions)占1.86%,見圖2。
圖2 GeneMANIA分析靶蛋白的相互作用
基于STRING結(jié)合Cytoscape通過degree篩選,選擇degree大于12的為關(guān)鍵靶點,EGFR、PTGS2和TLR4為關(guān)鍵靶點,見圖3。
圖3 關(guān)鍵靶點篩選
通過分子對接發(fā)現(xiàn),結(jié)果以斑蝥素和EGFR、PTGS2、TLR4大分子匹配能量的大小決定結(jié)合的程度。如果匹配能量比較低,說明小分子和大分子結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定。斑蝥素與3個靶點有結(jié)合。其中作用最好的為PTGS2,見表2。
表2 斑蝥素與靶標蛋白分子對接
近年來隨著多學科的交叉,系統(tǒng)生物學、計算生物學、蛋白質(zhì)組學等技術(shù)的融合,對中藥藥效物質(zhì)基礎的研究提供創(chuàng)新思路。網(wǎng)絡藥理學結(jié)合分子對接技術(shù),可以闡述機體與藥物相互作用的原理與規(guī)律,為中藥治療疾病的作用機制提供理論指導,目前網(wǎng)絡藥理學已被廣泛應用于中藥研究[14]。已經(jīng)有研究表明[15],斑蝥素具有抗肺癌的作用,本研究采用網(wǎng)絡藥理學篩選斑蝥素調(diào)節(jié)的靶標蛋白,通過與小細胞肺癌靶點進行整合,對靶標蛋白進行富集分析、關(guān)鍵靶點篩選,通過分子對接對關(guān)鍵靶點進行驗證分析,進一步探討其發(fā)揮防治小細胞肺癌的分子機制,從而為斑蝥素的應用及開發(fā)奠定基礎。
斑蝥素為中藥斑蝥中活性成分之一,為倍半萜類衍生物。斑蝥素藥理作用廣泛,具有較好的應用前景,臨床已經(jīng)應用斑蝥素注射液治療癌癥,而且具有較好的治療效果。本研究通過相互作用發(fā)現(xiàn),EGFR、PTGS2和TLR4為小細胞肺癌的核心靶點,通過分子對接驗證分析發(fā)現(xiàn)斑蝥素與PTGS2有結(jié)合,可能具有很好的相互作用。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS)包括組成型PTGS1和誘導型PTGS2,PTGS2又稱環(huán)氧合酶2(COX-2)[16]。在前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。結(jié)肺癌、直腸癌、食管癌、家族性腺瘤性息肉病組織中的PGE2水平升高,目前COX-2已成為抗癌藥物開發(fā)的新靶點[17-18]。Toll樣受體4(TLR4)在炎癥反應信號發(fā)揮作用,為最早的Toll樣受體亞型之一,在單核細胞、樹突狀細胞、小腸上皮細胞、中性粒細胞等均有表達,多種疾病與TLR4具有相關(guān)性[19];表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)突變或異常表達影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,EGFR在細胞增殖、信號傳導及各種調(diào)節(jié)機制發(fā)揮作用,但是多種腫瘤中過度表達并失去控制,因此研究EGFR靶向藥已經(jīng)成為熱點[20]。已經(jīng)有研究表明斑蝥素在抗病毒、抗腫瘤和增強免疫等功能,主要用于治療原發(fā)性肝癌,并對肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等有一定的療效[21]。本研究的篩選為斑蝥素在小細胞肺癌中的應用提供依據(jù)。