桂參通脈膠囊對(duì)心衰大鼠AngⅡ、ALD的影響

譚毅，徐洋，趙中秋，劉鑫，劉暢,梁君昭

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021)

慢性心力衰竭是由多種病因引起的心臟功能降低、結(jié)構(gòu)改變的復(fù)雜臨床綜合征。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以氣虛、陽(yáng)虛為主，標(biāo)實(shí)多為血瘀、水飲、痰濁。臨床上常見(jiàn)癥狀為驚、悸、喘、腫等，屬于“喘證”“胸痹”“水腫”等范疇。桂參通脈膠囊是梁君昭主任醫(yī)師及其團(tuán)隊(duì)在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)及前期提取工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等課題研究所研制出的治療心衰的經(jīng)驗(yàn)方[1]。該方已應(yīng)用于臨床10余年，在胸痹心氣虧虛、痰瘀互結(jié)導(dǎo)致的胸悶、心悸、氣喘、乏力、夜眠不安等方面有明顯療效[2]。本研究通過(guò)對(duì)心衰大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷乃幮W(xué)研究，分析桂參通脈膠囊對(duì)血漿AngⅡ、ALD 水平的影響，初步探討桂參通脈膠囊治療心力衰竭的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠66只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證：SYXK(陜)2017-002。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物經(jīng)測(cè)試確認(rèn)無(wú)異常行為。

1.2 藥物與試劑

桂參通脈膠囊：西安市中醫(yī)醫(yī)院提供，陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，批號(hào):130101、130302、130503，規(guī)格：0.45 g×36粒；陽(yáng)性對(duì)照藥物：卡托普利(北京太洋藥業(yè)有限公司，規(guī)格：25 mg/片)；注射用鹽酸阿霉素(鹽酸多柔比星，規(guī)格：10 mg/瓶，浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：100 mL/瓶)；肝素鈉注射液(南京新百藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2 mL∶1 000單位)；血漿 AngⅡ放射免疫分析藥盒(北京市福瑞生物工程公司)；血漿ALD放射免疫分析藥盒(北京市福瑞生物工程公司)；N-端腦鈉肽前體(NT-proBNP)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

MP120-1電子天平(上海第二天平儀器廠)，離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)，恒溫水箱(哈爾濱東聯(lián)公司)，石蠟包埋機(jī)，剪刀，灌胃針，導(dǎo)管，動(dòng)脈夾，注射器，止血鉗，手術(shù)線。

1.4 模型制備

參照《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》方法，將鹽酸阿霉素(ADR)溶解于5 mL滅菌注射用水中，再用生理鹽水配成每1 mL生理鹽水含 0.8 mg鹽酸阿霉素溶液。除正常對(duì)照組外，其余組大鼠分別于第1、3、5周腹腔注射阿霉素溶液(3 mg/kg)，于第 2、4、6 周腹腔注射阿霉素溶液(2 mg/kg)，每周1次，6周后每只大鼠累積用量15 mg/kg。同時(shí)予以正常對(duì)照組等容積的生理鹽水，腹腔注射，每周1次。造模第3周起，除正常對(duì)照組，其余各組大鼠陸續(xù)出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，精神差，不欲活動(dòng)，進(jìn)食減少，呼吸增快，脫毛等。從造模大鼠中隨機(jī)取6只用來(lái)檢驗(yàn)造模。處死后取出心臟，用生理鹽水洗凈血液，少許左心室肌，甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟切片， HE染色，光鏡下心肌細(xì)胞病理評(píng)分，結(jié)合大鼠行為體征變化[3]，判斷造模成功與否。

1.5 分組與給藥

選取成年雄性SD大鼠66只，隨機(jī)取10只作為空白對(duì)照組，56只大鼠造模后隨機(jī)取6只作為心衰模型檢驗(yàn)，其余大鼠隨機(jī)分為心衰模型組，桂參通脈膠囊低、中、高劑量組，卡托普利組，每組10只，共50只，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠給予腹腔注射鹽酸阿霉素進(jìn)行造模，每周1次。第5次腹腔注射后，分別予以相應(yīng)藥物灌胃治療。

給藥方法：第5次腹腔注射阿霉素后，按上述分組后進(jìn)行給藥：桂參通脈膠囊低劑量組：按0.034 g/(kg·d)配成10 mL/kg 灌胃，每日1次；桂參通脈膠囊中劑量組：按0.068 g/(kg·d)配成 10 mL/kg 灌胃，每日1次；桂參通脈膠囊高劑量組：按0.135 g/(kg·d)配成10 mL/kg灌胃，每日1次；卡托普利組：卡托普利片25 mg/片，研磨成細(xì)粉后配成混懸液，按 6.75 mg/(kg·d)配成10 mL/kg灌胃，每日1次；心衰模型組：予以蒸餾水10 mL/kg灌胃，每日1次；正常對(duì)照組：予以蒸餾水10 mL/kg灌胃，每日1次；連續(xù)給藥4周，每日上午10:00給藥。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

連續(xù)給藥4周后，將所有大鼠禁食(不禁水)12 h，給各組大鼠稱重并記錄，然后用1.5%戊巴比妥鈉0.25 mL/100 g腹腔注射麻醉，鈍性分離腹主動(dòng)脈，一次性腹主動(dòng)脈采血6～10 mL，抗凝處理，4 000 r/min離心10 min，取上清液，低溫保存；采血后取出大鼠心臟，用生理鹽水沖洗后取少許左心室肌，放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.7 觀察指標(biāo)

行為體征觀察:每周記錄大鼠體質(zhì)量，觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)能力、行為變化、食欲、呼吸頻率、皮毛色澤等情況。

檢測(cè)指標(biāo)：1)心肌組織形態(tài)學(xué)觀察：洗凈后，取少量左心室肌放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，脫石蠟，HE 染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞病理改變。2)血液指標(biāo)檢測(cè)：從腹主動(dòng)脈取6～10 mL血液，靜置30 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，恒溫冰箱保存。嚴(yán)格按照按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，采用放射免疫法(RIAS)檢測(cè)血漿AngⅡ、ALD和血清NT-proBNP的濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為體征變化

實(shí)驗(yàn)共用SD大鼠66只，造模期間無(wú)大鼠死亡，給藥期間(除去檢驗(yàn)造模6只大鼠)心衰模型組死亡2只大鼠，卡托普利組、桂參通脈膠囊低劑量組各死亡1只大鼠。自造模期間，前3周各組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，自第3周起，造模大鼠陸續(xù)出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，精神差，不欲活動(dòng)，進(jìn)食減少，呼吸增快，個(gè)別出現(xiàn)毛色干枯，脫毛(頸部、肩部、尾根部明顯)等癥狀；空白對(duì)照組大鼠精神良好，飲食正常，活動(dòng)迅速，反應(yīng)靈敏，未見(jiàn)脫毛且皮毛有光澤。給藥期間，桂參通脈膠囊低、中、高組及卡托普利組大鼠精神狀態(tài)、食欲、呼吸、皮毛色澤均有不同程的改善，其中桂參通脈高劑量組和卡托普利組一般情況及行為體征改善最為明顯。

2.2 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下觀察心肌細(xì)胞病理評(píng)分見(jiàn)表1。空白對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，無(wú)變性，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)間質(zhì)纖維化、水腫等情況發(fā)生；心衰模型組心肌細(xì)胞排列不齊，并有不同程度的溶解、斷裂，局部可見(jiàn)心肌細(xì)胞水腫、空泡樣改變，心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化，有散在的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；桂參通脈膠囊低、中、高劑量組和卡托普利組，大鼠心肌細(xì)胞排列尚齊，部分心肌細(xì)胞溶解，可見(jiàn)散在的心肌細(xì)胞空泡樣變，少有心肌細(xì)胞水腫，心肌間質(zhì)纖維化較心衰模型組改善，其中以桂參通脈膠囊中、高劑量組及卡托普利組對(duì)受損心肌細(xì)胞的改善最明顯，但桂參通脈膠囊中、高劑量組與卡托普利組比較心肌細(xì)胞病理評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 光鏡下心肌細(xì)胞病理評(píng)分比較

2.3 血漿AngⅡ、ALD檢測(cè)

各組大鼠測(cè)得血漿AngⅡ和ALD情況見(jiàn)表2。心衰模型組與正常對(duì)照組相比血漿AngⅡ和ALD水平明顯升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與心衰模型組比較，藥物干預(yù)各組血漿AngⅡ和ALD含量均有所降低，其中桂參通脈膠囊中、高劑量組和卡托普利組降低最多，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但桂參通脈膠囊中、高劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組血漿AngⅡ、ALD濃度比較

2.4 血清NT-proBNP檢測(cè)

各組心衰大鼠血清NT-proBNP均高于正常對(duì)照組，以心衰模型組升高最為明顯；藥物治療各組中，卡托普利組和桂參通脈膠囊高劑量組血清NT-proBNP濃度最低，桂參通脈膠囊中劑量組血清NT-proBNP略高上述兩組；藥物治療各組和心衰模型組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組血清NT-proBNP濃度比較

3 討論

心力衰竭是多種致病因素引起的心臟結(jié)構(gòu)及功能改變，最終導(dǎo)致心臟射血功能不足、舒張障礙的一種復(fù)雜臨床綜合征，是多種心血管疾病發(fā)展的終末階段。對(duì)于心衰發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，從器官到細(xì)胞再到基因，由淺入深。血流動(dòng)力學(xué)異常可導(dǎo)致一系列臨床癥狀,而神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過(guò)度激活導(dǎo)致心室重構(gòu)是心衰根本病理基礎(chǔ)。心室重構(gòu)包括心臟受損傷或負(fù)荷過(guò)重等因素導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞肥厚、心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)沉淀等一系列病理變化，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)、功能變化。

RAAS系統(tǒng)過(guò)度激活在心衰進(jìn)展中起著重要作用，心肌局部RAAS激活可直接引起心肌結(jié)構(gòu)改變，心肌肥厚、心肌間質(zhì)纖維化[4]。早期心衰 RAAS 的激活能夠提高心輸出量起到代償作用，而 RAAS 的持續(xù)激活會(huì)造成心肌細(xì)胞損傷，使心功能惡化[5]。AngⅡ和ALD使RAAS中最重要的激素，AngⅡ有強(qiáng)烈收縮血管作用，并促使心肌肥大、促心肌纖維化的發(fā)生[6]。同時(shí)血漿AngⅡ濃度的升高促使ALD分泌加重水、鈉潴留，造成腎損害，血容量增多，加重心臟前負(fù)荷。AngⅡ和ALD還會(huì)觸發(fā)膠原合成和成纖維細(xì)胞增殖，是心肌纖維化的發(fā)生的原因。本實(shí)驗(yàn)指標(biāo)顯示，與心衰模型組比較，桂參通脈膠囊中、高劑量組和卡托普利組血漿AngⅡ和ALD含量明顯降低，證明桂參通脈膠囊可降低血漿AngⅡ和ALD水平，對(duì)心衰有治療作用，可延緩心衰的進(jìn)展，對(duì)桂參通脈膠囊用于治療慢性心衰提供了理論依據(jù)。

NT-proBNP能夠反映心室收縮舒張功能障礙情況，主要在心肌收到壓力負(fù)荷增高時(shí)由左心室分泌，是公認(rèn)的心衰評(píng)價(jià)指標(biāo)[7]，對(duì)心衰嚴(yán)重程度判斷及預(yù)后有重要意義。有研究表明血漿BNP水平濃度對(duì)心源性死亡預(yù)測(cè)有重要的臨床意義[8]。在本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果顯示，藥物干預(yù)各組血清NT-proBNP濃度明顯低于心衰模型組，在卡托普利組和桂參通脈膠囊高劑量組血清NT-proBNP濃度最低，中劑量組稍高于以上兩組。提示桂參通脈膠囊可降低血清NT-proBNP濃度，對(duì)心衰預(yù)后起到積極作用。在病理結(jié)果顯示，藥物干預(yù)各組與心衰模型組相比，在桂參通脈膠囊中、高劑量組及卡托普利組可明顯修復(fù)心肌細(xì)胞損傷，心肌細(xì)胞的排列較模型組整齊，偶可見(jiàn)少許心肌纖維間質(zhì)水腫，同模型組比較區(qū)別明顯，可見(jiàn)桂參通脈膠囊可以修復(fù)受損的心肌細(xì)胞，抑制心室重構(gòu)。

桂參通脈膠囊應(yīng)用于臨床多年，對(duì)慢性心力衰竭患者具有顯著作用。該方由桂枝、黨參、黃芪、炒白術(shù)、茯苓、清半夏、葛根、川芎和醋延胡索等組成。全方重點(diǎn)突出補(bǔ)氣益心、活血通絡(luò)、化痰祛濁之功效。通過(guò)調(diào)整機(jī)體臟腑的陰陽(yáng)氣血、虛實(shí)正邪逐漸趨向平衡?？v觀全方，桂枝溫心助陽(yáng)，黨參健脾益氣為君，共達(dá)溫陽(yáng)補(bǔ)虛，固本祛邪;臣藥健脾，培補(bǔ)后天之本;佐藥行氣、活血、化痰、開郁并重;使藥配合君、臣、佐藥，使氣旺血行，開郁止痛。本方以君藥?kù)畛乇灾虏≈?，臣藥?kù)柟毯筇斐K傳病，佐藥?kù)钪虏∫蛩丶安±懋a(chǎn)物,使藥配合加強(qiáng)藥效。