大別山區(qū)野生羊肚菌生物學(xué)特性研究

王航，張琦，余祖華，黃維金，劉永東，楊忠品，王秋穎*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193; 2.騰沖市林業(yè)局林業(yè)技術(shù)推廣站，云南 騰沖 679100)

羊肚菌隸屬于子囊菌門(Ascomycota)盤菌綱(Discomycetes)盤菌目 (Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)[1]。因為其菌蓋具有網(wǎng)狀凸起酷似羊肚而得名。羊肚菌是一種珍貴的大型食藥用真菌，口味鮮美、營養(yǎng)豐富，含有多種氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)元素以及多糖、多酚、脂類、甾醇等成分，具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗氧化以及抗疲勞等作用[2-10]，具有補腎、壯陽、補腦和提神的功效，在國外食用菌中的受歡迎程度僅次于松露。

羊肚菌在我國分布較廣，從東北地區(qū)到云南山區(qū)，乃至新疆西藏、江蘇等地都有分布[11]。西方科學(xué)家在1986年首次在室內(nèi)成功栽培出羊肚菌子囊果后一直局限于室內(nèi)小面積栽培，并未實現(xiàn)大棚栽培；我國則在1992年在四川省首次大棚栽培成功。國外羊肚菌栽培由于菌種退化嚴(yán)重，且長期存在細(xì)菌污染，目前大量依賴進(jìn)口；我國由于大棚中溫度、濕度難以精確控制且子囊果形成機制尚不明了，栽培穩(wěn)產(chǎn)性差、子囊果易變型等問題一直沒有得到解決[12]。因此實現(xiàn)羊肚菌人工栽培的穩(wěn)定產(chǎn)出仍需要大量的試驗研究。本課題組在我國安徽六安大別山區(qū)成功分離到野生羊肚菌的菌絲，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，以期為羊肚菌的子囊果形成機制和穩(wěn)產(chǎn)條件等進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羊肚菌子囊果：采自安徽六安大別山區(qū)的野生羊肚菌子囊果。

羊肚菌株：野生羊肚菌子囊果分離純化得到的菌株。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL, pH值自然)；基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基(葡萄糖20 g，大豆蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲的分離與鑒定

分離：使用滅菌后的鑷子從子囊果菌柄上小心挑取5 mm×5 mm的組織塊，將其浸泡在0.1%的氯化汞溶液中2 min進(jìn)行表面消毒，使用無菌水反復(fù)沖洗后在超凈工作臺上接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，菌絲產(chǎn)生后立即使用接種針挑出并接入新的培養(yǎng)皿中，反復(fù)純化后獲得菌株。

鑒定：使用試劑盒法對分離得到的菌株進(jìn)行DNA提取，經(jīng)PCR擴增后對其ITS區(qū)進(jìn)行生物測序，然后對所得序列拼接后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。

1.2.2 菌絲、菌落形態(tài)的觀察

菌絲形態(tài)觀察：在剛接種羊肚菌的培養(yǎng)皿中向內(nèi)斜插一塊經(jīng)過滅菌的蓋玻片，25 ℃黑暗培養(yǎng)，待菌絲生長到蓋玻片上時，使用光學(xué)顯微鏡對菌絲形態(tài)進(jìn)行觀察。

菌落形態(tài)觀察：對接種的平板連續(xù)觀察10 d，并對其從菌落顏色、長勢和菌核數(shù)量等方面進(jìn)行記錄。

1.2.3 溫度、光照和pH值的篩選

溫度：培養(yǎng)溫度分別為0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、28 ℃和30 ℃，暗室培養(yǎng)7 d。

光照：處理分為連續(xù)光照培養(yǎng)、連續(xù)黑暗培養(yǎng)和12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)，25 ℃培養(yǎng)10 d。

pH值：pH值處理分別為4.5、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，25 ℃暗室培養(yǎng)7 d。

均采用平板培養(yǎng)法，在90 mm的培養(yǎng)皿中分別倒入15 mL經(jīng)高壓滅菌后的PDA培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基完全冷卻凝固后分別在培養(yǎng)基表面中央接入直徑7 mm的菌種塊。每個處理設(shè)置5個重復(fù)，每隔12 h使用游標(biāo)卡尺測量并記錄菌絲生長速度，同時觀察和記錄菌落顏色、長勢和菌核數(shù)量。

1.2.4 碳源、氮源的篩選

碳源：選用基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基，再分別使用20 g的麥芽糖、乳糖、蔗糖和可溶性淀粉對基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行替換，并且以不加碳源的培養(yǎng)基作為對照，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d。

氮源：選用基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基，再分別使用2 g的硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨和尿素對基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基中大豆蛋白胨進(jìn)行替換，并且以不加氮源的培養(yǎng)基作為對照，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d。

采用平板培養(yǎng)法，在90 mm培養(yǎng)皿中分別倒入15 mL經(jīng)高溫高壓滅菌后的各種培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻凝固后分別在培養(yǎng)基表面中央接入直徑7 mm的菌種塊。每個處理設(shè)置5個重復(fù)，每隔12 h使用游標(biāo)卡尺測量并記錄菌絲生長速度，同時觀察并記錄菌落顏色、長勢和菌核數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離與鑒定

分離：本次試驗一共得到了2種菌株。一種氣生菌絲發(fā)達(dá)、長勢旺盛，菌絲初期純白色，第3天起從中心位置開始變成青色，5 d左右滿皿，最后菌絲全部變成黑色，無菌核產(chǎn)生，命名為L1；另一種氣生菌絲較少，初期僅產(chǎn)生透明、稀疏的匍匐菌絲，從第2天起菌絲開始變黃并出現(xiàn)氣生菌絲，3 d左右滿皿且在滿皿后有菌核產(chǎn)生，命名為L2。

鑒定：序列經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫比對后顯示本次分離所得菌種L2是Morchellaconica，為羊肚菌的一種；L1為Phomamultirostrata，可能是羊肚菌的伴生菌。見圖1。

圖1 比對結(jié)果

2.2 菌絲、菌落形態(tài)

菌絲形態(tài)：初期菌絲無色透明，僅有匍匐菌絲且比較稀疏，分支較少；從第2天開始，菌絲顏色開始變黃，開始產(chǎn)生分支，氣生菌絲開始增多，且不同菌絲產(chǎn)生的分支有接合現(xiàn)象。見圖2。

圖2 羊肚菌的菌絲形態(tài)

菌落形態(tài)：在PDA培養(yǎng)基上羊肚菌生長較快，3 d左右滿皿，邊緣整齊。菌絲滿皿后，從菌種塊附近開始產(chǎn)生大量白色菌核，并隨著培養(yǎng)時間的增長顏色逐漸加深，最后變成與菌絲一致的淡黃色；后期產(chǎn)生較多色素，使得培養(yǎng)基局部顏色變?yōu)樽厣?。見圖3。

圖3 羊肚菌的菌落形態(tài)

2.3 不同環(huán)境條件下羊肚菌菌絲的生長情況

2.3.1 溫度

羊肚菌菌絲在5 ℃～28 ℃均可以生長，在0 ℃和30 ℃時菌絲停止生長。在5 ℃～25 ℃時，隨著溫度的增加，生長速度也逐漸加快。此后隨著溫度繼續(xù)增加，生長速度開始減慢，30 ℃時菌絲停止生長。在5 ℃～10 ℃時菌落白色，菌絲生長緩慢，匍匐菌絲稀疏、氣生菌絲較少，無明顯菌核產(chǎn)生，長勢較差；在15 ℃時菌絲開始略微發(fā)黃，菌絲生長速度較慢，匍匐菌絲稀疏、氣生菌絲較少且有少量菌核產(chǎn)生，長勢一般；在20 ℃～22 ℃時，菌落顏色略微發(fā)黃，菌絲生長速度較快，氣生菌絲增多，有較多菌核產(chǎn)生，長勢一般；在24 ℃～26 ℃時，菌落淡黃色、氣生菌絲較多，菌落邊緣平整，菌核數(shù)量和大小與20 ℃～22℃處理的樣品相比均有增加，長勢旺盛；在28 ℃時，菌落顏色略微發(fā)黃，菌絲生長較慢，匍匐菌絲稀疏、氣生菌絲較少，有少量菌核產(chǎn)生，長勢一般。

不同溫度處理下，菌絲生長速度在滿皿之前都隨著培養(yǎng)時間增加而有不同程度的加快，為了方便比較、觀察，比較生長速度時選取滿皿之前整體的平均值。見表1?？芍蚨蔷?5 ℃～26 ℃時，菌絲生長速度均超過了18 mm/d，長勢最好，顏色為淡黃色，菌核數(shù)量多。

表1 不同溫度下羊肚菌菌絲和菌核的生長情況

2.3.2 光照

羊肚菌菌絲在全天光照、全天黑暗、12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)條件下均能生長，長勢都很旺盛，均產(chǎn)生較多菌核。全天光照條件下菌落淡黃色，菌核顏色淡黃、數(shù)量較多、體積較小且有聚集現(xiàn)象，菌絲分泌較多色素，培養(yǎng)基部分變?yōu)樽厣?；全天黑暗下，菌落淡黃色且比全天光照處理的顏色要深，菌絲分泌的色素較少，菌核顏色較深且會聚集生成一個大的深黃色菌核；12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)條件下菌落淡黃色且與全天黑暗處理的顏色相近，氣生菌絲較多，在培養(yǎng)基邊緣聚集成圈，菌絲分泌少量色素在培養(yǎng)基上產(chǎn)生少量棕色斑點，菌核顏色較深且也聚集生成大的深黃色菌核，但是比全天黑暗條件下產(chǎn)生的略小。見圖4。

3種處理方式生長速度略有差異，菌絲生長速度在滿皿之前同樣隨著培養(yǎng)時間增加而逐漸加快，為了方便比較生長速度，也選取滿皿之前整體的平均值。見表2。全天光照、全天黑暗、12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)條件處理的羊肚菌絲平均生長速度分別達(dá)到了16.84 mm/d、18.20 mm/d、17.56 mm/d。整體而言，全天黑暗條件下羊肚菌落長勢最好，菌絲生長速度最快，然后是12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)和全天光照培養(yǎng)。

表2 不同光照條件下羊肚菌菌絲和菌核生長情況

圖4 不同光照處理下羊肚菌的菌落形態(tài)

2.3.3 pH值

由于PDA培養(yǎng)基在pH值≤4.0和pH值>12.0時不凝固，所以本實驗pH值選取范圍為4.5～12.0。

羊肚菌在pH值4.5～12.0時均可以生長，且在不同pH值處理的培養(yǎng)基上生長情況有差異。在pH值4.5時菌絲稀疏、生長速度緩慢，略微發(fā)黃，氣生菌絲和菌核較少，長勢較差；在pH值為5.0時菌絲生長速度較快，菌落局部變黃，氣生菌絲和菌核較多，長勢一般；在pH值6.0～9.0時菌絲生長快，菌落淡黃色，氣生菌絲和菌核多，長勢旺盛，其中在pH值7.0和7.5時有少量色素產(chǎn)生，在pH值7.0時菌絲生長速度最快，平均速度達(dá)到了18.99 mm/d；在pH值10.0時，菌絲白色，氣生菌絲和菌核較多，長勢一般；在pH值11.0和12.0時，菌絲白色，有氣生菌絲產(chǎn)生，無菌核產(chǎn)生，長勢較差。所以適合羊肚菌生長的pH值為7.0。具體見表3和圖5。

2.4 不同營養(yǎng)條件下羊肚菌菌絲、菌落的生長情況

2.4.1 碳源

羊肚菌菌絲在5種碳源以及不加碳源的對照中均可以生長，且不同碳源處理的羊肚菌菌絲生長情況存在差異。剛接入菌種塊時，菌絲生長較慢，隨著時間的增長，生長速度越來越快，但是此后由于培養(yǎng)皿中氧氣消耗過多，菌絲生長速度都有不同程度的減緩。當(dāng)碳源為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖時，最大生長速度分別達(dá)到了17.21 mm/d、17.23 mm/d、17.53 mm/d、17.49 mm/d，不加碳源的培養(yǎng)基上菌絲最大生長速度為16.70 mm/d，而當(dāng)碳源為可溶性淀粉時最大生長速度僅為14.35 mm/d。見圖6。

表3 不同pH值處理羊肚菌菌絲、菌核的生長情況

選取平均速度后，碳源為葡萄糖時菌絲生長最快，其次分別為乳糖、麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉。整體而言，羊肚菌菌絲在葡萄糖培養(yǎng)基上生長旺盛，菌落淺黃色且有少量色素產(chǎn)生，菌核數(shù)量多；在麥芽糖培養(yǎng)基上長勢旺盛，但生長速度比在葡萄糖培養(yǎng)基上略慢，菌落淺黃色且有少量色素產(chǎn)生，菌核數(shù)量多；在乳糖培養(yǎng)基上，菌落淺黃色且有少量色素產(chǎn)生，菌絲較稀疏、長勢一般，菌核較多且分散；在蔗糖培養(yǎng)基上，菌落略微發(fā)黃，菌絲較稀疏、長勢一般，菌核數(shù)量較多；在可溶性淀粉培養(yǎng)基上菌落略微發(fā)黃，菌絲較稀疏、長勢一般，菌核較多；在不添加碳源的培養(yǎng)基上與添加葡萄糖的培養(yǎng)基上相比，雖然在生長速度方面相差無幾，但是菌絲較為稀疏、長勢較差，且無菌核產(chǎn)生。由此可見最適合羊肚菌菌絲生長的碳源為葡萄糖。見表4。

圖5 不同pH值處理下羊肚菌的菌落形態(tài)

表4 不同碳源處理羊肚菌菌絲、菌核生長情況

2.4.2 氮源

羊肚菌菌絲在5種氮源和不加氮源的培養(yǎng)基上均可以生長，且不同氮源處理的羊肚菌菌絲生長情況存在差異。與不同碳源處理類似，不同氮源處理的羊肚菌菌絲在剛接入菌種塊時生長速度較慢，隨著時間的增長，生長速度越來越快，此后由于培養(yǎng)皿中氧氣消耗過多，菌絲生長速度同樣都有不同程度的減緩。當(dāng)?shù)礊槁然@、硝酸鉀、大豆蛋白胨和硫酸銨時，羊肚菌菌絲的最大生長速度分別達(dá)到了17.98 mm/d、17.87 mm/d、17.21 mm/d、17.20 mm/d；當(dāng)?shù)礊槟蛩貢r羊肚菌菌絲最大生長速度為14.42 mm/d；而在不加氮源的培養(yǎng)基上最大生長速度僅為11.57 mm/d。見圖7。

圖6 不同碳源處理下羊肚菌的菌落形態(tài)

圖7 不同氮源處理下羊肚菌的菌落形態(tài)

選取平均生長速度后，氮源為硝酸鉀時生長速度最快，其次分別為大豆蛋白胨、硫酸銨、氯化銨，最后是尿素。整體而言，在硝酸鉀培養(yǎng)基上菌絲生長狀態(tài)最好，菌絲淡黃色、分泌較多色素且有大量氣生菌絲產(chǎn)生，但是菌核產(chǎn)生很少;菌絲在大豆蛋白胨上生長旺盛，菌絲淡黃色、氣生菌絲較多，且有少量色素產(chǎn)生和大量菌核產(chǎn)生；在硫酸銨和氯化銨培養(yǎng)基上長勢旺盛，氣生菌絲較多，但是菌絲呈白色，且無菌核產(chǎn)生；在尿素上長勢一般，雖有大量氣生菌絲產(chǎn)生，但是菌絲白色且生長緩慢，無菌核產(chǎn)生；在無氮培養(yǎng)基上長勢較差，菌絲幾乎透明且極為稀疏，無氣生菌絲以及菌核產(chǎn)生。由此可見最適合羊肚菌生長的氮源是硝酸鉀。見表5。

表5 不同氮源處理羊肚菌菌絲、菌核生長情況

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，安徽大別山區(qū)野生羊肚菌在溫度25 ℃～26 ℃，pH值7.0，黑暗條件下平板培養(yǎng)時，長勢最好，菌絲淡黃色，生長最快、氣生菌絲最多且有菌核產(chǎn)生。最適合羊肚菌生長的碳源和氮源分別為葡萄糖和硝酸鉀。

目前羊肚菌已經(jīng)實現(xiàn)了人工栽培，但是可用于人工栽培的菌株寥寥無幾，而且由于大田中溫度、濕度等條件難以控制，羊肚菌大田產(chǎn)量極不穩(wěn)定。由于菌種和培養(yǎng)條件的不同，不同學(xué)者在研究羊肚菌生物學(xué)特性時得到的結(jié)論有很大差異，在最佳碳源和氮源方面差別尤其顯著[13-20]。本次試驗結(jié)果可以為目前野生資源短缺、無法人工獲得穩(wěn)定產(chǎn)量的羊肚菌的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

羊肚菌子囊果僅由一層薄薄的菌肉構(gòu)成，分離時很難挑取內(nèi)部的菌肉。與其他食藥用真菌相比，羊肚菌菌絲在平板培養(yǎng)時生長比較稀疏，氣生菌絲很少，匍匐菌絲居多，產(chǎn)生較多分支使培養(yǎng)基表面產(chǎn)生“反光”的效果，容易誤以為是細(xì)菌污染。在實驗室平板培養(yǎng)時羊肚菌絲在25 ℃～26 ℃生長最快，而在自然界中最適合羊肚菌生長的溫度為15 ℃～22 ℃[11]?？赡苁怯捎谘蚨蔷z在25 ℃～26 ℃延展最快，但是在15 ℃～22 ℃菌絲數(shù)量多、生物量較大且有利于原基的產(chǎn)生。羊肚菌在平板培養(yǎng)時，極少受到雜菌污染，在與雜菌的競爭中也有明顯優(yōu)勢，而且對pH值的適應(yīng)范圍很廣，可能是存在某些抗逆性基因。以上結(jié)果產(chǎn)生的原因有待進(jìn)一步實驗驗證。