紫玉蘭MlSOC1基因亞細(xì)胞定位及花芽分化時期的表達(dá)分析

宣鈴娟，程少禹，戴夢怡，王卓為，申亞梅

（浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，杭州311300）

開花是植物由營養(yǎng)生長過渡到生殖生長必須經(jīng)歷的一個重要環(huán)節(jié)，這一環(huán)節(jié)是由外部環(huán)境因子和植物內(nèi)在因子共同決定的[1]。植物在長期的進化過程中受到很多信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控，在對模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，植物中共存在6條成花途徑，包括光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、溫度途徑、自主成花途徑和年齡途徑[2-3]。植物在受到外界環(huán)境或內(nèi)源物質(zhì)等釋放的成花信號的刺激后，將信號傳導(dǎo)到3 個主要的成花整合因子FT（FLOWERING LOCUS T）、LFY（LEAFY）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1）中，信號被接收后通過相互作用傳遞給花器官決定基因，進而作用于下游花分生組織，促進植物開花[4-8]。

SOC1 基因的功能域和結(jié)構(gòu)域在單子葉和雙子葉植物中都相對比較保守，其編碼的蛋白屬于MADS 盒（MADS-box）家族，主要由MADS 盒、K盒、I區(qū)和C末端等組成[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，MADS盒基因在花分生組織的發(fā)育中扮演重要角色，并在成花調(diào)控過程方面也有非常突出的作用[11-12]。目前，在紫斑牡丹（Paeonia suffruticosa）[13]、薺菜（Brassica juncea）[14]、紅 掌（Anthurium sp.）[15]、蝴 蝶 蘭（Phalaenopsis sp.）[16]等多種植物中均已克隆得到SOC1 基因序列，但在木蘭科木蘭屬植物中還未見到有關(guān)于SOC1基因的報道。

紫玉蘭（Magnolia liliflora）是備受人們歡迎的木蘭科木蘭屬植物，具有悠久的種植歷史。紫玉蘭花期相對其他木蘭屬植物晚，屬于晚春開花型植物，因其具有良好的觀賞價值，在園林應(yīng)用特別是庭院綠化方面具有重要作用。在木蘭屬育種方面，紫玉蘭還是優(yōu)良的育種木本[17]，通常被用作母本植物進行育種。鑒于SOC1 基因的重要調(diào)控作用，開展紫玉蘭SOC1基因的深入研究對其成花機制的揭示具有重要的指導(dǎo)意義，可為木蘭屬植物其他種或品種的研究提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為種植于浙江農(nóng)林大學(xué)玉蘭路的10年生紫玉蘭。于2019年4—6月不同時期采摘紫玉蘭不同成花階段的葉和花芽，一部分放入甲醛-乙醇-乙酸（formalin-alcohol-acetate, FAA）混合固定液中，另一部分迅速放入液氮中，隨后置于－80 ℃超低溫冰箱中儲存，備用。

1.2 紫玉蘭花芽分化形態(tài)特征觀察

待紫玉蘭花落盡且展新枝之后，每隔7 d 采集一次新枝頂端花芽的樣，取一部分芽于體式顯微鏡下觀察其外部形態(tài)特征，同時采10～15個芽用標(biāo)準(zhǔn)固定液保存，用于石蠟切片觀察[18]。

1.3 MlSOC1-1 和MlSOC1-2 基因的克隆

紫玉蘭花芽的總RNA用純植物RNA提取試劑盒[購自天根生化科技（北京）有限公司]進行提取，并用核酸分析儀對提取的總RNA 質(zhì)量進行檢測。以提取質(zhì)量合格的RNA作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTMRT Master Mix）[購自寶生物工程（大連）有限公司]反轉(zhuǎn)錄成cDNA 的第1 鏈[19]。用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，并將引物序列（表1）送至生工生物工程（上海）有限公司進行合成，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）對MlSOC1-1 和MlSOC1-2 進行克隆。將PCR 產(chǎn)物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。目的條帶采用MiniBEST 瓊脂糖凝膠DNA 提取試劑盒（日本TaKaRa 公司）進行切膠回收、利用后，連接到pMD18-T 載體上并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。然后經(jīng)過氨芐青霉素（ampicillin）抗性篩選，將陽性克隆菌液經(jīng)PCR 檢測后送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

表1 紫玉蘭MlSOC1基因克隆、表達(dá)分析及載體構(gòu)建相關(guān)引物Table 1 Primers for cloning,expression analysis and vector construction of MlSOC1 in M.liliflora

1.4 MlSOC1-1 和MlSOC1-2 的序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/project/grorf）在線網(wǎng)站查詢MlSOC1-1和MlSOC1-2基因的開放閱讀框；利用DNAman軟件進行核苷酸序列的翻譯和同源性比對；通過NCBI 網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的Blastx 進行基因氨基酸同源性比對[19]；最后通過MEGA 6.0 軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建和分析。

1.5 MlSOC1-1 和MlSOC1-2 載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位載體選用pCMBIA1302，在37 ℃條件下通過限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SpeⅠ對載體和目的基因（表1）進行3 h 的雙酶切，然后用T4 連接酶對雙酶切后的目的基因和載體質(zhì)粒于16 ℃條件下進行過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，并涂布于含有卡那霉素（kanamycin）抗性的Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑取白色單菌落進行擴繁，以擴繁后的菌液為模板經(jīng)PCR擴增和產(chǎn)物測序獲得正確的陽性克隆，從而得到亞細(xì)胞定位的重組載體pCMBIA1302-MlSOC1-1/2。

將載體pCMBIA1302-MlSOC1-1/2 通過凍融法轉(zhuǎn)入GV3101 農(nóng)桿菌感受態(tài)中，搖菌4～5 h 之后取少量上清培養(yǎng)液，吹打混勻菌體，涂于含有卡那霉素和利福平抗生素的酵母甘露醇培養(yǎng)基（yeast mannitol medium,YEB）上，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)2 d后挑取單菌落，28 ℃搖菌16 h 后進行菌落PCR 驗證，正確的菌液接種于YEB液體培養(yǎng)基中進行搖菌擴繁2～3 d，直至D（600 nm）≈2.0后，離心收集菌體并用懸浮液將菌體稀釋至D（600 nm）≈0.1。稀釋后的侵染液用于洋蔥表皮侵染實驗。選取生長健康的洋蔥暗培養(yǎng)3 d之后，用刀片去除洋蔥表面鱗片，然后用注射器將菌懸液注入洋蔥第2—3 層處的表皮，并用記號筆圈出注射的位置；繼續(xù)暗培養(yǎng)3 d后，撕下洋蔥表皮并置于載玻片上，采用Axio-Imager_LSM-800 激光共聚焦顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）進行觀察。

1.6 MlSOC1-1 和MlSOC1-2 的表達(dá)分析

將紫玉蘭不同成花階段葉和花芽的cDNA模板稀釋10倍，于－20 ℃條件下保存，用于實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR）。以Actin為內(nèi)參基因，用Primer 5.0 軟件設(shè)計不同時期花芽和葉的熒光定量PCR 反應(yīng)引物（表1），送至生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA 模板2 μL，熒光染料SYBR 10 μL，上游引物和下游引物各0.8 μL，用ddH2O 補足至20 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s，40 個循環(huán)；用Light Cycler 480 軟件計算閾值（CT）大小，采用2－△△CT計算方法分析表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫玉蘭花芽分化過程中的形態(tài)特征變化

紫玉蘭于晚春開花，在木蘭屬植物中為花葉同開類型。經(jīng)過近一個月的新枝抽梢，在頂端開始出現(xiàn)新芽。在花芽分化過程中，芽外部依次形成幾層被白色或淺褐色毛的佛焰苞狀苞片。紫玉蘭每年只進行一次花芽分化，從5 月初開始頂芽分化，至6月中上旬分化結(jié)束。根據(jù)石蠟切片的結(jié)果，可將紫玉蘭花芽分化劃分為6個時期（圖1）：未分化期（S1）、分化初期（S2）、萼片原基分化期（S3）、花瓣原基分化期（S4）、雄蕊原基分化期（S5）和雌蕊原基分化期（S6）。從芽的外部形態(tài)可以看出，隨著內(nèi)部器官的逐漸發(fā)展，芽漸漸膨大飽滿，顏色由淡黃綠色變深至棕褐色，并且外層被絨毛，絨毛變多且變得蓬松（圖1A～F）。從花芽的內(nèi)部來看，未分化期芽體積生長點較小，隨著分化的進行，內(nèi)部花芽原基開始變大，出現(xiàn)生長錐，生長錐上出現(xiàn)突起，最后雌蕊原基分化，完成整個花芽分化過程（圖1G～L）。

圖1 紫玉蘭花芽分化過程Fig.1 Process of flower bud differentiation in M.liliflora

2.2 紫玉蘭MlSOC1-1 和MlSOC1-2 基因的克隆

通過對景寧木蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的篩選，得到2 條SOC1 基因的序列信息，采用同源基因克隆及基因PCR 克隆驗證的方法，得到了MlSOC1-1 和MlSOC1-2基因的核苷酸序列。其中：MlSOC1-1編碼區(qū)長666 bp，編碼221 個氨基酸；MlSOC1-2 編碼區(qū)長654 bp，編碼217 個氨基酸（圖2）。通過DNAman 軟件對MlSOC1-1 和MlSOC1-2 的核苷酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，這2 個基因序列的同源性為75.3%；因此，我們認(rèn)定這是2個不同的基因，可能在功能、組成成分等方面存在差異，而不是同一基因通過可變剪切形成的不同剪接體。

2.3 MlSOC1-1 和MlSOC1-2 的生物信息學(xué)分析

圖2 MlSOC1-1和MlSOC1-2基因核苷酸序列比對Fig.2 Nucleotide sequence alignment of MlSOC1-1 and MlSOC1-2 genes

通過與其他物種的多個氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，紫玉蘭MlSOC1-1 和MlSOC1-2 編碼的氨基酸序列與其他物種中SOC1編碼的氨基酸序列的同源性都達(dá)了65%以上，且與木蘭科植物更為相近，序列同源性達(dá)90%以上。同時發(fā)現(xiàn)，MlSOC1-1 和MlSOC1-2 與其他植物如葡萄（Vitis vinifera）、大豆（Glycine max）等一樣具有典型的SOC1-MOTIF 保守序列（圖3），說明MlSOC1-1和MlSOC1-2基因都屬于SOC1/TM3亞家族中的成員。

為了研究紫玉蘭MlSOC1-1 和MlSOC1-2 蛋白在進化過程中與其他植物的親緣關(guān)系，選取一些單子葉和雙子葉植物的SOC1蛋白，用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。結(jié)果表明：紫玉蘭MlSOC1-1蛋白與皺葉木蘭（M.praecocissima）中的SOC1蛋白親緣關(guān)系最近，而MlSOC1-2 與北美木蘭（M.virginiana）中的SOC1 蛋白親緣關(guān)系最近；同時，MlSOC1-1和MlSOC1-2與荷花（Nelumbo nucifera）、煙 草（Nicotiana tabacum）、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）等一些雙子葉植物中的SOC1 蛋白有一定的親緣性，而與小麥（Triticum aestivum）、海棗（Phoenix dactylifera）等單子葉植物中的SOC1 蛋白親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2.4 紫玉蘭MlSOC1-1 和MlSOC1-2 基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建pCMBIA1302-MlSOC1-1/2 的重組質(zhì)粒，如圖5 所示。轉(zhuǎn)化DH5α 后，通過菌液PCR 驗證，將挑選出的單菌落陽性克隆菌液送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序和序列比對，結(jié)果表明pCMBIA1302-MlSOC1-1/2-GFP載體已構(gòu)建成功。將pCMBIA1302-MlSOC1-1/2-GFP 融合載體及空載體（pCMBIA1302原始載體）分別轉(zhuǎn)化至洋蔥表皮細(xì)胞，在培養(yǎng)一段時間后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察重組載體和空載體的表達(dá)位置發(fā)現(xiàn)，pCMBIA1302-MlSOC1-1/2載體均在核內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光，重組載體的表達(dá)蛋白被定位于細(xì)胞核內(nèi)，而對照載體則可以在整個細(xì)胞中表達(dá)（圖6），這說明MlSOC1-1/2編碼的蛋白均屬于核蛋白。

2.5 MlSOC1-1 和MlSOC1-2 在紫玉蘭成花過程不同階段中的表達(dá)分析

為了解MlSOC1-1 和MlSOC1-2 基因在紫玉蘭花芽分化不同階段（S1～S6）的表達(dá)差異性，分別提取不同花芽分化期紫玉蘭葉和花芽的總RNA，再將這些RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)稀釋后作為模板進行qRT-PCR 分析。結(jié)果（圖7）顯示：在紫玉蘭不同時期的葉片中，從未分化期到分化初期，MlSOC1-1表達(dá)量明顯增加（P＜0.01），隨后表達(dá)量整體呈逐漸降低趨勢；而MlSOC1-2 表達(dá)量從未分化期開始就呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，直至雄蕊原基分化期才有所提高。在花芽中，紫玉蘭花芽分化不同時期MlSOC1-1基因表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢，而MlSOC1-2基因在分化初期的表達(dá)量就高于其他時期，之后表達(dá)量開始下降，至雌蕊原基分化期時其表達(dá)量達(dá)到最低，趨向于不表達(dá)。

圖3 MlSOC1-1和MlSOC1-2氨基酸序列與其他物種SOC1氨基酸序列的比對Fig.3 Sequence alignment of MlSOC1-1 and MlSOC1-2 with SOC1 amino acid sequences of other species

圖4 紫玉蘭MlSOC1-1和MlSOC1-2蛋白與其他物種SOC1蛋白的進化樹Fig.4 Phylogenetic tree between MlSOC1-1/2 proteins and SOC1 proteins of other species

圖5 載體構(gòu)建示意圖Fig.5 Schematic diagram of vector construction

圖6 MlSOC1-1/2蛋白亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of MlSOC1-1/2 proteins

根據(jù)MlSOC1-1 和MlSOC1-2 基因在紫玉蘭花芽分化不同階段葉片和花芽中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，2個基因無論是在葉片還是花芽中，其表達(dá)模式均有所差異，其中：MlSOC1-1的表達(dá)模式為由高到低再升高，該基因在成花轉(zhuǎn)變及花芽分化初期具有較高的表達(dá)量，且在花芽分化的花瓣原基分化期到雌蕊原基分化期，其表達(dá)量開始不斷上升，表明MlSOC1-1基因除了參與紫玉蘭芽的成花轉(zhuǎn)變外，還有可能對紫玉蘭花器官的合成有一定作用。MlSOC1-2基因僅在成花轉(zhuǎn)變及花芽分化初期具有較高的表達(dá)量，而在花芽分化的花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期表達(dá)量不斷下降，這表明MlSOC1-2基因可能僅對紫玉蘭芽的成花轉(zhuǎn)變起到一定作用，而對花器官發(fā)育的作用并不明顯。

3 討論

開花是植物從營養(yǎng)生長過渡到生殖生長的一個重要過程[1,20]，相比擬南芥等草本植物，紫玉蘭需要經(jīng)歷較長的童期（指實生樹從種子播種萌發(fā)開始到具有花芽分化潛力及開花結(jié)果的階段）才能實現(xiàn)向生殖生長的轉(zhuǎn)變。了解紫玉蘭開花轉(zhuǎn)變的過程對加速紫玉蘭的品種改良具有十分重要的意義。紫玉蘭在花芽分化的時間進程上與其他木蘭屬相比稍有不同，但是在形態(tài)特征上與木蘭屬和鵝掌楸屬[18,21-22]相一致。研究發(fā)現(xiàn)，MADS盒基因在植物生長過程中具有調(diào)節(jié)生長發(fā)育的多種功能[23-24]，SOC1作為MADS盒基因家族中重要的成花整合因子，在控制植物開花時間上發(fā)揮重要作用，并廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中[9,25]。

圖7 MlSOC1-1和MlSOC1-2在不同花芽分化期葉和花芽中的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of MlSOC1-1 and MlSOC1-2 of leaves and flower buds in different flower bud differentiation periods

在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物只存在一個SOC1同源基因，只有少數(shù)物種具有多個SOC1同源基因[26]。本次試驗在紫玉蘭中發(fā)現(xiàn)2個SOC1基因，經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，其序列同源性并不一致。MlSOC1-2的氨基酸序列與MlSOC1-1 有一定的差異性，但通過多物種氨基酸同源蛋白序列比對以及系統(tǒng)進化樹分析，判斷MlSOC1-1 和MlSOC1-2 屬于MADS 盒家族基因且是SOC1 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，因而判定紫玉蘭中不止一個SOC1 同源基因。SOC1 基因?qū)儆贛ADS 盒基因，通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)MlSOC1-1和MlSOC1-2 基因均屬于SOC1/TM3 支系[10]。從有關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，屬于該支系的SOC1 基因與植物的花分生組織特性及成花誘導(dǎo)相關(guān)[27]。

木蘭屬植物的花芽分化期較短，一般在4—6月，其花芽分化期可分為未分化期、分化初期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期[19-20]。本研究通過實時熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn)，MlSOC1-1 和MlSOC1-2 基因在不同花芽分化期的表達(dá)量及表達(dá)模式有所不同，這表明MlSOC1-1 和MlSOC1-2 基因在調(diào)控紫玉蘭成花過程中發(fā)揮的作用有所差異。在MlSOC1-1的表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)，MlSOC1-1前期參與成花轉(zhuǎn)變，后期可能同時參與花器官的合成；因此推測，MlSOC1-1可能對花分生組織的下游基因MlLFY[28]起調(diào)控作用，從而進一步調(diào)控C 類基因AG 的表達(dá)，促進雄蕊原基和雌蕊原基的分化[29-30]。而MlSOC1-2 基因在花芽未分化期到分化初期表達(dá)量呈上升趨勢，這可能與MlSOC1-2在紫玉蘭中由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的作用有關(guān)，這與PmSOC1 基因在梅花花芽分化過程的調(diào)控結(jié)果[31]相一致。近幾年的研究也發(fā)現(xiàn)：在擬南芥中，AtSOC1的表達(dá)量隨著植株的生長而不斷提高，尤其在成熟葉片中的表達(dá)量最高[32]；在月季中，RhSOC1 則在頂芽中的表達(dá)量最高[33]；在梅花中，PmSOC1基因在成年樹和幼苗中的表達(dá)量有一定的差異[31]。本文對紫玉蘭中的SOC1 基因進行分離鑒定、表達(dá)模式分析和亞細(xì)胞定位等，初步了解了SOC1 基因在紫玉蘭成花過程中的作用，并為研究紫玉蘭SOC1基因如何響應(yīng)上游調(diào)控因子及如何與其他MADS盒開花相關(guān)基因、蛋白相互作用的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

基于景寧木蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到的2 個SOC1 基因，通過同源基因克隆的方法得到它們的核苷酸序列，并通過比較它們的同源性，可以排除是同一基因通過可變剪切形成不同剪接體的可能。在亞細(xì)胞定位試驗過程中發(fā)現(xiàn)，這2 個基因都定位于核蛋白上，無太大的差異。同時，通過qRT-PCR對MlSOC1-1 和MlSOC1-2 基因在不同花芽分化階段葉和花芽中的表達(dá)情況進行分析研究發(fā)現(xiàn)：MlSOC1-1 的表達(dá)呈現(xiàn)由高到低再升高的模式；MlSOC1-2基因僅在成花轉(zhuǎn)變及花芽分化初期具有較高的表達(dá)量，而在花芽分化的中后期表達(dá)量不斷下降，說明這2 個基因在花芽分化過程中起著不同的作用。而MlSOC1-1 和MlSOC1-2 在組成成分和表達(dá)上的不同是否會導(dǎo)致其對紫玉蘭花芽分化過程調(diào)控造成差異，尚有待進一步研究。