一例河蟹病原體腐敗希瓦菌的檢測(cè)診療與分析

陳 瑜 李 勇 倪 亞

(1.泗陽縣三莊鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 泗陽 223700；2.泗陽縣水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 泗陽223700；3.泗陽縣倪亞水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 泗陽 223700)

2019 年8 月26 日筆者接診泗陽縣南劉集漁場(chǎng)黃某的河蟹病樣，進(jìn)行病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)與檢測(cè)，并對(duì)分離純化得到的病原菌株進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)。經(jīng)檢測(cè)該塘河蟹致病菌為腐敗希瓦菌，該菌株對(duì)硫酸新霉素最為敏感，對(duì)其他試驗(yàn)藥物敏感性較差。這一檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用于塘口治療效果較為顯著，具體情況如下。

一、病情概述

1.蟹農(nóng)主訴：年初扣蟹放養(yǎng)規(guī)格160 只/千克、密度2 500只/畝，8月底平均規(guī)格雄蟹125克/只、雌蟹75 克/只。自8 月初陸續(xù)發(fā)現(xiàn)河蟹零星死亡，從最初15～20 只/天逐漸發(fā)展，1 周后上升至80～100只/天，8月26日200多只發(fā)病死亡。其間于當(dāng)?shù)貪O藥店多次購藥治療，先后連續(xù)21 天服用過恩諾沙星、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶鈉，改底與調(diào)水3次，消毒1次，但不見任何效果，病蟹數(shù)量不降，越來越多。

2.接診察看：發(fā)病塘口面積30 畝，池形東西長、南北寬，四周環(huán)溝寬4米、水深1米，塘中淺水面平均水深0.6 米，水草占比60%。池塘水源充沛、進(jìn)排水方便。巡塘發(fā)現(xiàn)，病蟹趴邊、無力、反應(yīng)遲鈍、遇驚不退避，少數(shù)病蟹上岸吐沫、易捕捉、翻身不起，外觀體色灰暗、四肢較干凈。

3.解剖檢查：蟹鰓絲棒樣水腫，部分黑鰓、爛鰓，腸無食，胃內(nèi)泡沫樣脹氣，肝胰腺呈暗黃色、無光澤。

4.寄生蟲檢查：低倍鏡(×10)顯微檢查鰓絲及附肢絨毛，未見固著類纖毛蟲寄生。

5.水質(zhì)檢測(cè)：上午10:00檢測(cè)水質(zhì)，水體溶解氧5.3 毫克/升、pH 8.3、氨氮0.2 毫克/升、亞硝酸鹽0.01毫克/升。

6.水樣鏡檢：池水中以小球藻、柵藻、盤星藻、裸藻等藻類為主，浮游動(dòng)物見少許橈足類，其浮游生物量豐度適中。

二、病菌分離純化培養(yǎng)與藥物敏感性試驗(yàn)

選取具有典型癥狀瀕死河蟹，于無菌操作實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離純化培養(yǎng)檢測(cè)鑒定和菌株對(duì)藥物感受性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前用75%酒精擦拭消毒河蟹體表，于無菌操作凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無污染解剖，剪取肝胰腺少許，放入盛有15 毫升經(jīng)高壓滅菌營養(yǎng)肉湯增菌液的50 毫升離心管中，放置于生化培養(yǎng)箱28℃、24 小時(shí)增菌培養(yǎng)；18～24 小時(shí)后對(duì)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行普通營養(yǎng)瓊脂平板劃線分離接種，重置于生化培養(yǎng)箱中28℃、24 小時(shí)培養(yǎng)；18～24 小時(shí)挑取培養(yǎng)皿單一菌落，再次劃線分離純化培養(yǎng)(28℃、24 小時(shí))；24 小時(shí)后挑取菌落配制成0.5 麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，按照梅里埃API-20E細(xì)菌鑒定試劑條操作流程，將菌懸液滴加到試劑條每個(gè)生化反應(yīng)小杯管中，置于恒溫生化培養(yǎng)箱中37℃、24 小時(shí)培養(yǎng)，18～24 小時(shí)比色判讀鑒定。另外，用無菌棉簽蘸取1個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶反應(yīng)試驗(yàn)比色判讀。鑒定結(jié)果：API-20E 生化序號(hào)為0600004，菌株為腐敗希瓦菌，鑒定率97.2%，革蘭氏染色陰性、桿菌。菌株生化反應(yīng)鑒定判讀結(jié)果見表1。

表1 API-20E鑒定試劑條生化反應(yīng)判讀結(jié)果

同時(shí)，用移液槍吸取配制好的0.5麥?zhǔn)隙染鷳乙?.2毫升，加到20毫升無菌生理鹽水中在V形槽內(nèi)混勻，然后用微量移液排槍吸取加入到藥敏板所有微孔中(陰性對(duì)照除外)，每孔加0.2毫升，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 小時(shí)。藥敏試驗(yàn)操作依據(jù)南京菲恩動(dòng)物用藥敏分析96 孔試劑板操作流程。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

藥敏試驗(yàn)表明：本次河蟹染病病原體腐敗希瓦菌對(duì)8種所試藥物的感受性，對(duì)硫酸新霉素強(qiáng)敏感，MIC 為0.39 微克/毫升，為本次疾病治療的首選用藥；而恩諾沙星為25微克/毫升、鹽酸多西環(huán)素為50 微克/毫升、磺胺甲噁唑＋甲氧芐啶為(512＋102)微克/毫升，病原菌株對(duì)這3 種藥物耐受性極強(qiáng)，屬低敏感度，最小抑菌濃度值相對(duì)較高，用藥的血藥濃度必須達(dá)到較高峰值才可抑菌見效，選藥上要慎重，盡量不選；其他4種藥物在設(shè)置濃度試驗(yàn)范圍內(nèi)無法抑制病菌繁殖，該菌株對(duì)其耐藥，選藥時(shí)徹底舍棄。

三、試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用

經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷此次河蟹致病病原體為腐敗希瓦菌。癥狀表現(xiàn)為鰓絲水腫，部分爛鰓，胃脹氣，腸炎，蟹背胸甲潰瘍、腐殼等。應(yīng)用菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果，篩選試驗(yàn)強(qiáng)敏感藥物硫酸新霉素處方內(nèi)服，劑量為河蟹每千克體重5 毫克(以新霉素計(jì))，每天1 次，連用7 天，同時(shí)外潑氨基酸碘1次。治療3天后死蟹減半，5天后減少至10 只/天，7 天后死蟹消失，河蟹攝食量上升，活力變強(qiáng)，病情得以控制。

四、分析與小結(jié)

1.本病例提示細(xì)菌性病害應(yīng)求病原鑒定與藥敏試驗(yàn)選藥的精準(zhǔn)性，不可囿于以往的盲選藥物。此病例在沒做藥敏試驗(yàn)前，養(yǎng)殖戶選恩諾沙星、氟苯尼考、磺胺類等藥物用了21 天未見效果，其原因在于此病致病菌為腐敗希瓦菌，而經(jīng)藥敏試驗(yàn)，該菌株對(duì)恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、甲砜霉素、氟甲喹、磺胺類等表現(xiàn)為低敏甚至不敏，盲目用藥必致無效。相反，找準(zhǔn)極敏感藥物硫酸新霉素給病蟹用藥，效果立顯。

2.本次藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)馗瘮∠Ｍ呔鷮?duì)多種藥物都有較強(qiáng)耐藥性，這給因該菌株感染的病害防控選藥上帶來一定的困難，增加了治療難度。

3.本病例如排除池塘生態(tài)環(huán)境誘病因素外，應(yīng)當(dāng)考慮河蟹長期投喂冰凍海魚的影響，一些已變質(zhì)而未被發(fā)現(xiàn)的凍魚投喂是否存在攜帶腐敗希瓦菌病原的可能性，有待于進(jìn)一步溯源檢測(cè)。

表2 8種藥物對(duì)河蟹腐敗希瓦菌株最小抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)結(jié)果 微克/毫升