基于iTRAQ技術篩選紅欖李種子響應敗育差異表達蛋白

李衛(wèi)錦，張靜文 ，袁長春，張 穎，

（1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048；2.海南師范大學生命科學學院/熱帶島嶼生態(tài)學教育部重點實驗室，海南 海口 571158）

【研究意義】紅樹林是重要的海洋資源，紅樹植物具有較強的耐潮汐能力，多分布在熱帶、亞熱帶海岸。紅樹林在沿海生態(tài)系統(tǒng)修復中發(fā)揮重要作用，但紅樹植物與陸生植物相比種類極少［1］。隨著全球經(jīng)濟和環(huán)境的影響［2-3］，紅樹植物瀕危程度增加。引起紅樹物種瀕危的原因有植物長期進化的內(nèi)在因素以及一些外部因素。其中，有性生殖障礙是影響物種瀕危的重要原因之一。紅欖李〔Lumnitzera littorea（Jack.）Voigt〕為使君子科（Combretaceae）非胎生紅樹植物，分布于印度、斯里蘭卡、緬甸、馬來西亞、泰國和我國的海南［1,4］。由于自然界和人類活動的影響，該物種的種群出現(xiàn)高度破碎化并持續(xù)受到高度干擾［5］。在我國，紅欖李僅自然分布于海南的三亞和陵水，由于分布區(qū)域狹小、種子敗育和個體數(shù)量稀少而瀕臨滅絕［4-7］。目前紅欖李已被列為國家二級保護植物，在世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）紅色名錄中被列為受威脅物種［8］。2006—2018年該物種的生物學和生態(tài)學特征被相繼報道［4-7,9］，但相關研究中對紅欖李種子敗育的分子機制仍未知。

【前人研究進展】質譜定量分析方法已經(jīng)成為植物蛋白質組研究的一個重要工具。同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術在植物蛋白組學中的應用越來越廣泛［10］。iTRAQ技術已應用在植物根、葉、花藥、殼和芽等各組織蛋白質組的鑒定中［10-12］。此外，植物對鹽脅迫、干旱脅迫、滲透壓、熱、鋁、汞和煙草花葉病毒（TMV）［12-15］等環(huán)境脅迫的響應也已使用iTRAQ技術進行分析。應用iTRAQ技術已鑒定出陸地棉［13］、小麥［16］、番茄［17］和葡萄［18］等胚胎發(fā)育過程中的相關蛋白?！颈狙芯壳腥朦c】瀕危植物紅欖李是國家二級保護植物，種子敗育是影響其瀕危的一個重要因素。本研究通過iTRAQ技術初步分析其種子敗育的分子機制?！緮M解決的關鍵問題】借助iTRAQ定量蛋白質組學技術分析紅欖李不同育性種子蛋白質組的表達差異。對質檢合格的兩個蛋白質組進行酶解，iTRAQ標記后進行高效液相色譜、質譜檢測；利用Mascot軟件進行蛋白質鑒定，通過iTRAQ定量尋找差異表達蛋白，并進行GO功能注釋、KEGG代謝通路和蛋白互作分析，并通過實時熒光定量PCR對候選差異表達基因進行驗證，以期探討紅欖李種子敗育過程的分子機制。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

收集紅欖李花瓣完全脫落后的種子?？捎N子采集于泰國東海岸（12°23′N，102°16′E）的Lam Ri-ngun和Chanthaburi，敗育種子采集于海南省三亞市鐵爐港紅樹林保護區(qū)（18°15′N，109°42′E）。刀剖種子檢測胚是否發(fā)育。

1.2 蛋白質提取與定量

采用Kambiranda等［18］的方法提取紅欖李幼嫩種子的蛋白質，采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒（Thermoffisher Scientific, UN, China）對蛋白質進行定量分析（具體操作見說明書），最后將定量好的蛋白質保存在-80℃冰箱中備用。

1.3 iTRAQ標記與SCX分餾

取100 μg總蛋白，加入Trypisn Gold溶液（樣品∶試劑＝30∶1），37 ℃消化16 h，真空離心干燥獲得肽段干粉。用0.5 mol/L的TEAB復溶肽段，然后按照iTRAQ Reagen t8-plex試劑盒（SCIEX,Madison, WI, USA）進行標記（具體操作見說明書）。使用LC-20AB HPLC（Shimadzu, Kyoto, Japan）高效液相色譜系統(tǒng)進行SCX色譜分析（具體操作見說明書）。

1.4 基于QEXACTIVE的LC-ESI-MS/MS分析

采用LC-20AD納米高效HPLC液相系統(tǒng)（Shimadzu, Kyoto, Japan），根據(jù)說明書用緩沖液A懸浮肽段，終濃度約為0.5 μg/μL。用自動進樣系統(tǒng)吸入10 μL上清液，置于2 cm的C18捕集柱上，然后洗脫入10 cm 的C18分析柱（內(nèi)徑75 μm）上。將樣品以8 μL/min的速度加載4 min，然后使用濃度梯度2%～35%的緩沖液B（98% ACN，0.1% FA）以300 nL/min的流速運行44 min；接著在2 min內(nèi)使緩沖液B濃度上升至80%，保持4 min；最后在1 min內(nèi)使緩沖液B濃度降到5%。將肽段通過納米液相色譜系統(tǒng)（HPLC）分離，該系統(tǒng)直接與Q-EXACTIVE質 譜 儀（MS，ThermoFisher Scientific, San Jose,CA）連接，分離的樣品進入Q-EXACTIVE質譜儀分析。MS掃描，一級MS全掃描的m/z范圍為350～2 000 u，二級MS全掃描的m/z范圍為100～1 800 u。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用 Proteome Discoverer 1.2（PD 1.2，Thermo）軟件和5600 MS轉換器將從Orbitrap獲得的原始質譜數(shù)據(jù)轉換成MGF文件。蛋白質的鑒定使用Mascot軟 件（Version 2.3.02, Matrix Science Inc.,MA, USA），選擇已經(jīng)建立好的紅欖李轉錄組數(shù)據(jù)庫（NCBI登錄號：SRP127706）進行數(shù)據(jù)庫檢索。蛋白質鑒定，完整肽段匹配誤差控制在20 mg/L以內(nèi)，片段匹配誤差控制在0.02 u以內(nèi)，胰蛋白酶消化最多允許1個發(fā)生錯位。為了減少肽段鑒定的假陽性，待鑒定蛋白須符合Mascot概率分析軟件鑒定多肽的置信區(qū)間為99%以上，且在置信區(qū)間內(nèi)顯著性得分≥20。每個可信的鑒定蛋白都至少含有1個unique肽段。

1.6 生物信息學分析

在蛋白質定量過程中，要求每個蛋白至少包含2個unique肽段。使用Mascot軟件中位數(shù)比值對蛋白質的量進行測定和標準化。當P＜0.05且差異倍數(shù)＞1.5時認為該蛋白差異顯著。

利用Gene Ontology（GO）軟件將差異表達蛋白與GO-Annotation@EBI網(wǎng)站下載的數(shù)據(jù)進行比對分析。為明確差異表達蛋白的生物學功能特性，采 用 COG（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/） 和KEGG（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）數(shù)據(jù)庫進行差異蛋白分析。蛋白質的互作網(wǎng)絡分析使用STRING軟件［19］。

1.7 實時熒光定量PCR

為驗證iTRAQ結果，根據(jù)姚嘉龍等［20］的方法選擇8個候選基因對蛋白質組鑒定結果進行驗證。使用Primer Express軟件（Applied Biosystems）引物設計，引物序列見表1。以基因ubiquitin為內(nèi)參，基因相對表達量的計算公式為F=2-ΔΔCt。

2 結果與分析

2.1 質譜鑒定結果

以紅欖李可育種子和敗育種子建立蛋白質組，通過iTRAQ技術檢測共得到206 580個質譜，通過Mascot 軟件分析，33 481個質譜匹配到已知質譜，30 435個質譜與獨特的肽相匹配。另鑒定出6 138個已知肽段、5 769個unique肽和2 380個蛋白。肽段的數(shù)量分布如圖1所示，其中至少包含2個unique肽段的蛋白質占比47%以上。而大于4肽的蛋白數(shù)量占比12.52%。

圖1 蛋白數(shù)量分布Fig. 1 Distribution of protein number

2.2 不同育性種子差異表達蛋白的生物學過程及生物學功能特性分析

在敗育種子中共鑒定出448個差異表達蛋白，其中上調蛋白238個（53%）、下調蛋白210個（47%）。根據(jù)生物學過程進行分類，其中1.86%的蛋白與生殖相關，16.45%的蛋白參與代謝過程，15.78%的蛋白參與細胞過程，還有10.74%的蛋白被分類為單一生物過程蛋白（表2）。生物學功能特性分析結果表明，大多數(shù)蛋白都參與RNA加工和轉運、細胞運動、無機離子轉運和代謝、翻譯后修飾以及蛋白質更新和蛋白伴侶等過程（圖2）。

表1 候選基因qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences for the candidate proteins

2.3 不同育性種子差異表達蛋白GO分析

GO分析結果表明，大多數(shù)差異表達蛋白主要參與了內(nèi)質網(wǎng)蛋白的加工、RNA轉運、RNA降解、囊泡轉運的SNARE相互作用、植物信號轉導以及mRNA的監(jiān)測等生物學途徑（表3）。圖3所示蛋白相互關系，參照表3中蛋白號得出，與內(nèi)質網(wǎng)蛋白加工相關差異蛋白中的sec13同源蛋白、熱休克蛋白（Hsp70）、DNA修復蛋白（RAD23-3）、核轉錄因子、轉運相關蛋白和去泛素保護蛋白（dph1）下調，而UDP-葡萄糖轉移酶和內(nèi)質網(wǎng)素上調；與RNA轉運相關的差異表達蛋白伸長因子-1-α、真核生物翻譯起始因子3亞基B和C、小泛素相關修飾因子2、聚腺苷酸結合蛋白2和4、依賴ATP的DEAD-盒子RNA解旋酶38以及程序性細胞死亡蛋白4均為上調表達，而真核翻譯起始因子3亞基f（elF3f）和RAN GTPase激活蛋白2在紅欖李敗育種子中出現(xiàn)下調表達；與RNA降解相關差異表達蛋白中，只有Hsp70和烯醇化酶2表現(xiàn)為下調，其余蛋白如熱休克結合蛋白1、U6 snRNA相關Sm類蛋白LSm5和多聚腺苷酸結合蛋白2和4均為上調；與SNARE相互作用相關差異表達蛋白Syntaxin-132結合121和52上調，而Syntaxin-23和24下調；葡聚糖內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶3是唯一的植物激素信號轉導相關的上調蛋白；紅欖李敗育種子中與mRNA監(jiān)測相關的差異表達蛋白多聚腺苷酸結合蛋白表達量上調。

表2 不同育性種子差異表達蛋白的生物學過程分析Table 2 Biological process of the differentially expressed proteins of different fertility seeds

圖2 不同育性種子差異表達蛋白的功能分類Fig. 2 Functional classification of the differentially expressed proteins in different fertility seeds

表3 敗育紅欖李種子中差異表達蛋白的GO分析Table 3 Differentially expressed proteins in abortive L. littorea seeds by GO analysis

2.4 不同育性種子差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證

圖3 敗育種子中差異表達蛋白的互作網(wǎng)絡Fig. 3 Protein interaction network of the differentially expressed proteins in abortive seeds

為了驗證iTRAQ分析的結果，在GO分析的基礎上從差異表達蛋白中篩選出8個候選基因進行qRT-PCR檢測，從轉錄表達層面上對蛋白質組鑒定結果進行驗證。其中4個基因RAD23、protein714、Syntaxin-121、依賴ATP的DEAD-盒子RNA解旋酶基因在敗育種子中上調表達，而另外4個基因17.9 ku的Ⅱ類熱休克蛋白基因、去泛素保護蛋白dph1基因、葡聚糖內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶基因、羧酸酯酶基因則下調表達（圖4）。在這8個差異基因中除了RAD23外其他7個基因的表達量與蛋白質組檢測結果一致。

3 討論

在我國，瀕危紅樹植物紅欖李存在嚴重的有性生殖障礙，表現(xiàn)為種子敗育率高，在沒有人工輔助育種的情況下種子萌發(fā)率幾乎為零［6,8］，存在大量空胚現(xiàn)象［5,8］。但通過人工輔助育種等技術手段可實現(xiàn)紅欖李種子的萌發(fā)和幼苗撫育［4］。本研究利用iTRAQ的方法分析了紅欖李敗育種子和可育種子的蛋白組學差異情況，旨在揭示我國紅欖李種子發(fā)育過程中種子敗育的分子機制。在448個差異表達蛋白中，內(nèi)質網(wǎng)加工、RNA轉運、RNA降解、SNARE在囊泡運輸中的相互作用、植物激素信號轉導和mRNA監(jiān)測等7類植物生理生化過程的蛋白都表現(xiàn)出不同的表達量。前人研究發(fā)現(xiàn)，這些相關蛋白均不同程度參與陸地棉［13］、小麥［14］、金魚草［21］、番茄［22］、大豆［23］、擬南芥［24］、玉米［25］等眾多植物的胚胎發(fā)育過程，且不同程度調控植物的育性。這些差異蛋白的揭示為研究紅欖李種子敗育機制和采用基因工程手段進行深入研究提供了研究基礎。

3.1 內(nèi)質網(wǎng)加工蛋白

在敗育紅欖李種子中有11種內(nèi)質網(wǎng)加工相關蛋白差異表達，其中sec13同源蛋白、DNA修復蛋白（RAD23-3）表達下調。在擬南芥中，sec13同源蛋白1通過控制AtDRP2A的膜結合在液泡運輸中發(fā)揮作用［26］。在金魚草花發(fā)育過程中，RAD蛋白通過抑制DIV蛋白的表達抑制花的發(fā)育［21］，而花的發(fā)育狀態(tài)直接影響種子的發(fā)育進程。在番茄果實發(fā)育過程中，類RAD蛋白的功能非常保守，但其表達卻由環(huán)境和分子結合伴侶共同決定［22］。前期研究表明，參與淀粉代謝相關蛋白的表達會調控大豆雄性不育性狀［23］。本研究中紅欖李敗育種子的UDP-葡萄糖轉移酶出現(xiàn)了上調表達。植物的內(nèi)質網(wǎng)素對植物蛋白分泌代謝起重要作用，對植物組織的生長起促進作用［27］，該類蛋白在紅欖李敗育種子的蛋白質組中表現(xiàn)為上調。

3.2 RNA轉運

圖4 差異表達基因的qRT-PCR驗證Fig. 4 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

植物延長因子參與細胞周期進程和部分細胞延長過程中蛋白質的合成。本研究在敗育種子差異表達蛋白中發(fā)現(xiàn)了一種參與RNA翻譯過程的因子即延長因子-1-α，以及其他7種蛋白，包括真核生物翻譯起始因子3亞基B和C、小泛素相關修飾因子2、聚腺苷酸結合蛋白2和4、依賴ATP的DEAD-盒子RNA解旋酶38以及程序性細胞死亡蛋白4，均為上調表達。已有研究表明，翻譯起始因子可控制擬南芥熱響應性生長的翻譯終止和終止密碼子的通讀［24］，同時也會影響植物幼苗mRNA的選擇性翻譯［28］。RNA解旋酶是一種依賴NTP水解釋放能量來解旋雙鏈RNA分子的酶。RNA解旋酶與RNA分子所有活動過程相關，包括核轉錄、剪切、核糖體生物合成、RNA輸出和細胞器的基因表達，廣泛參與植物的生長發(fā)育和脅迫反應［25］。另外3種RNA轉運相關蛋白SEC13同源蛋白OS、真核翻譯起始因子3亞基f（elF3f）和RAN GTPase激活蛋白2在紅欖李敗育種子中出現(xiàn)下調表達。elF3f蛋白表達與植物的小配子發(fā)生有關，從而影響花粉育性和種子發(fā)育情況［29］。RAN類蛋白是ras超家族中一種保守的小信號GTPase，參與RNAs和蛋白質的核質運輸［30］。同時也參與有絲分裂過程，包括DNA的合成調控，紡錘體組裝，中心體復制，染色體排列、分離和解聚和核膜形成等［31］。在馬鈴薯中，RAN GTPase激活蛋白2在其免疫防護中發(fā)揮重要作用［32］。

3.3 RNA降解

在RNA降解相關蛋白中，熱休克蛋白（HSP）、谷胱甘肽S-轉移酶、抗壞血酸過氧化物酶和銅/鋅超氧化物歧化酶均積極參與植物胚胎發(fā)育過程且發(fā)揮重要作用［26,31-32］。本研究鑒定出了一些小分子量的熱休克蛋白，如22 ku的Ⅱ類和17.9 ku的I類熱休克蛋白，這些小分子量的熱休克蛋白參與大豆的胚胎發(fā)育過程［33］。由蛋白互作網(wǎng)絡圖可見，HSP蛋白表現(xiàn)上調，而UGGT蛋白表現(xiàn)下調，這兩種蛋白質協(xié)同作用，可能在紅欖李敗育種子的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

3.4 囊泡運輸中的SNARE相互作用

在植物細胞中SNAER介導的囊泡運輸將細胞壁和膜上的物質傳遞到細胞表面，在細胞的穩(wěn)態(tài)、擴張和生長中發(fā)揮重要作用［34］。SNAER蛋白參與植物對細菌的抗性和病理相關蛋白的分泌［35］，能夠增強植物對干旱和病原體的抗性［36］。前期研究表明，紅欖李敗育種子受病害和蟲害的比例極高［4-6］。本研究參與到囊泡運輸中的SNARE相互作用的差異表達是否為紅欖李種子發(fā)育過程中對病害和蟲害的應急響應仍需要持續(xù)驗證。

3.5 植物激素信號轉導

在屬于植物激素信號轉導的蛋白中，內(nèi)切-1,3-β-葡聚糖酶廣泛分布在細菌、真菌和高等植物中，可以水解多糖的特定糖苷鍵（β-1,3-葡聚糖殘基鍵）。在紅欖李敗育種子中葡聚糖內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶3是唯一與植物激素信號轉導相關的上調蛋白。內(nèi)切-1,3-β-葡聚糖酶常在整個植物體內(nèi)表達，在小花、葉鞘和葉片中高度表達，它也是水稻花粉發(fā)育過程中胼胝質降解所必需的［37］。在敗育紅欖李種子中，兩個與病理相關蛋白表現(xiàn)下調，這兩個蛋白是植物激素信號轉導蛋白中較為重要的蛋白，受到生物和非生物脅迫誘導［38］。

3.6 mRNA監(jiān)測途徑

本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA監(jiān)測途徑中的差異蛋白有3個，其中2個功能未知，1 個為聚腺苷酸結合蛋白。通過蛋白質組表達譜比較分析發(fā)現(xiàn)，多聚腺苷酸結合蛋白與水稻溫敏性雄性不育相關［39］。酵母多聚腺苷酸結合蛋白基因（PAB1）在植物中表達時可作為一種致病模擬基因［40］。在紅欖李敗育種子中多聚腺苷酸結合蛋白表達量上調。葡萄糖和植物激素（如ABA、GA和乙烯）協(xié)同調控植物種子的萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育。真核生物釋放因子1-2（在半不育種子中表達量下調）影響擬南芥種子萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育過程中對葡萄糖和植物激素的響應［41］。

4 結論

本研究借助iTRAQ技術對紅欖李不同育性種子的蛋白質組表達差異進行分析，經(jīng)GO分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異表達轉錄因子參與了內(nèi)質網(wǎng)蛋白加工、RNA轉運、RNA降解、囊泡轉運的SNARE相互作用、植物信號轉導和mRNA監(jiān)測途徑。而許多研究都證明這些差異表達轉錄因子大多與花粉和種子發(fā)育、種子萌發(fā)、幼苗早期發(fā)育、環(huán)境脅迫和抗病性有關。在GO分析的基礎上篩選出8個候選基因進行qRT-PCR分析，結果顯示有7個基因的表達量與蛋白質檢測結果一致，這從轉錄表達層面上對蛋白質鑒定的結果進行了驗證，從而肯定了蛋白質組檢測結果的正確性，為紅欖李敗育種子的分子機制深入研究奠定了基礎。