PEG模擬干旱脅迫對(duì)白菜型春油菜芽期生長(zhǎng)特性的影響

高 雪，尼瑪扎西，劉國(guó)一，譚海運(yùn)

（省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，西藏 拉薩 850000）

【研究意義】近年來(lái)，水資源供需失衡是世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)面臨的最嚴(yán)重問(wèn)題之一，供水不足嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制一直是遺傳育種領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。我國(guó)油菜種植面積和產(chǎn)量居世界首位［1］，油菜種植區(qū)季節(jié)性干旱大面積頻發(fā)，加之種植區(qū)內(nèi)全年降水量分布不均，對(duì)油菜種植過(guò)程造成巨大影響。干旱導(dǎo)致油菜無(wú)法正常播種、出苗慢、出苗不齊，甚至種植面積減少?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根系是固定植物及吸收水分、運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官。對(duì)根系的研究及調(diào)查工作費(fèi)時(shí)費(fèi)工，而且田間調(diào)查取樣容易造成根系結(jié)構(gòu)破壞，這些增加了根系調(diào)查的難度。在長(zhǎng)期研究及實(shí)際工作中，研究者及育種家更多關(guān)注植物地上部分對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)根系干旱響應(yīng)機(jī)制研究相對(duì)較少［2］。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下玉米根重與產(chǎn)量呈正相關(guān)，并檢測(cè)到與根系相關(guān)的16個(gè)QTLs位點(diǎn)與干旱脅迫響應(yīng)有關(guān)［3］。不同耐旱性水稻在聚乙二醇6000（PEG6000）溶液處理后，對(duì)耐旱性強(qiáng)品種（系）根系特征方面的影響顯著小于抗旱性弱的品種（系）［4］。陳檢鋒等［5］研究認(rèn)為，玉米根系抗氧化能力的強(qiáng)弱可以區(qū)分抗旱級(jí)別。干旱脅迫對(duì)甘藍(lán)型油菜幼苗期根鮮重和側(cè)根數(shù)具有明顯抑制作用，主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)可作為甘藍(lán)型油菜早期初步抗旱性鑒定的重要輔助指標(biāo)［2］。不同生理期內(nèi)，作物的生理反應(yīng)機(jī)制可用于篩選抗旱性品種（系）［6］。相對(duì)水分含量、脯氨酸、脅迫指數(shù)可作為小麥抗旱性強(qiáng)弱的鑒定指標(biāo)［7］。一定干旱脅迫程度下，甘藍(lán)型油菜葉片中葉綠素、類胡蘿卜素含量隨干旱程度加劇而降低，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、丙二醛含量及抗氧化酶系統(tǒng)活性則隨著干旱程度的加劇而升高［8］。萌發(fā)期采用10% PEG6000溶液脅迫處理，顯示抗旱指數(shù)、發(fā)芽率、根長(zhǎng)、苗高和根體積等指標(biāo)可作為甘藍(lán)型油菜早期初步篩選抗旱性材料的鑒定指標(biāo)［9］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】西藏地區(qū)春油菜播種期干旱少雨，選育、篩選出抗旱性白菜型春油菜品種（系）能很好解決播種期干旱少雨的情況［10］。采用PEG6000溶液模擬干旱脅迫研究白菜型春油菜抗旱性的方法，重復(fù)性好、周期短、實(shí)驗(yàn)條件易于控制，可快速篩選抗旱性白菜型春油菜品種（系）?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用不同濃度PEG6000溶液模擬干旱脅迫，探索白菜型春油菜幼苗對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制，篩選適宜的PEG6000濃度及抗旱性白菜型春油菜品種（系），為西藏白菜型春油菜抗旱性育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

124220-1、藏油3號(hào)、104005、093431等4個(gè)品種（系）白菜型春油菜種子由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院資源與環(huán)境研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

干旱脅迫參考米超等［11］方法進(jìn)行，發(fā)芽試驗(yàn)參考GB/T3543.4-1995。為保證試驗(yàn)一致性，分別隨機(jī)選取各品種（系）白菜型春油菜種子1 000粒，先用5% NaClO溶液消毒5 min，再用蒸餾水沖洗干凈，以三層濾紙為芽床，置于25℃自然光下萌發(fā)，5 mL蒸餾水保濕。待種子露白，選取100粒正常發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)至PEG6000溶液為培養(yǎng)液（濃度分別為0%、5%、10%、15%、20%、25%）的培養(yǎng)皿（直徑12 cm，芽床由五層吸水紙及一層濾紙構(gòu)成）繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，以培養(yǎng)液為蒸餾水為對(duì)照，每個(gè)培養(yǎng)皿為1個(gè)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)箱設(shè)置條件：晝/夜溫度25℃/18℃，時(shí)長(zhǎng)14h/10 h，光照條件為4 000 lx，脅迫處理時(shí)間為7 d。脅迫處理結(jié)束后統(tǒng)計(jì)白菜型春油菜幼苗存活數(shù)，計(jì)算成苗率；隨機(jī)選取20株測(cè)定幼苗苗高、主根長(zhǎng)、單株鮮重等形態(tài)指標(biāo)，并計(jì)算相對(duì)活力指數(shù)、傷害率：

相對(duì)活力指數(shù)=處理成苗率×處理幼苗苗高；

取整株材料測(cè)定丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白（SPr）含量及超氧化物酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［12］，3次重復(fù)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜型春油菜芽期幼苗形態(tài)指標(biāo)對(duì)PEG脅迫的響應(yīng)

不同濃度PEG6000溶液模擬干旱脅迫后各品種（系）白菜型春油菜的成苗率見表1。由表1可知，124220-1成苗率由96.02%下降至32.37%，傷害率由10.82%增加至66.29%；藏油3號(hào)成苗率由93.33%下降至32.33%，傷害率由7.56%增加至65.36%；104005成苗率由92.67%下降至32.37%，傷害率由7.92%增加至61.88%；093431成苗率由95.33%下降至25.58%，傷害率由16.33%增加至73.16%。隨干旱脅迫加劇，白菜型春油菜成苗率呈下降趨勢(shì)，傷害率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中124220-1在每個(gè)處理梯度的傷害率均略大于其他品種，而104005均略低于其他3個(gè)品種。

從表1、表2可以看出，不同濃度PEG6000溶液脅迫后，各品種（系）白菜型春油菜平均苗高124220-1由45.33%降至14.98%，其中，藏油3號(hào)由29.43%降至10.11%，104005由31.39%降至9.02%，093431由27.57%降至11.26%；主根長(zhǎng)124220-1由23.98%降至8.67%，藏油3號(hào)由25.3%降至11.23%，104005由19.33%降至10.62%，093431由24.33%降至12.58%；單株鮮重124220-1由60.25%降至25.25%，藏油3號(hào)由50.41%降至28.81%，104005由43.89%降至23.84%，093431由51.18%降至34.89%；相對(duì)活力指數(shù)124220-1由0.70降至0.11，藏油3號(hào)由0.70降至0.12，104005由0.73降至0.13，093431由0.69降至0.10。平均苗高、單株鮮重、主根長(zhǎng)、相對(duì)活力指數(shù)均隨PEG6000溶液濃度增加而下降，幼苗各指標(biāo)（平均苗高、單株鮮重、主根長(zhǎng)）傷害率亦同時(shí)增加。4個(gè)品種（系）白菜型春油菜各生長(zhǎng)特性指標(biāo)傷害率大小不同，其中，124220-1各指標(biāo)略大于其他3個(gè)品種（系），為104005＞093431＞藏油3號(hào)＞124220-1，抗旱性相對(duì)強(qiáng)弱排序亦如此。

以相對(duì)活力指數(shù)作為作物抗旱性鑒定指標(biāo)已用于實(shí)際工作［11-12］，在15% PEG6000溶液濃度時(shí)，各品種（系）白菜型春油菜相對(duì)活力指數(shù)在50%～60%之間，成苗率分別為69.67%、68.67%、66.33%、59.67%，20%濃度成苗率分別為32.37%、32.33%、35.33%、25.58%?？蓪?5%～20%濃度范圍作為白菜型春油菜模擬干旱脅迫的適宜濃度，對(duì)應(yīng)滲透壓約為-0.4MPa［13］。

2.2 白菜型春油菜芽期幼苗抗氧化酶活性對(duì)PEG脅迫的響應(yīng)

從圖1可以看出，隨PEG6000溶液濃度升高，在5%～15%濃度范圍內(nèi)，4種白菜型春油菜SOD、POD、CAT活性均呈升高趨勢(shì)。各溶液濃度脅迫下的白菜型春油菜SOD活性均大于對(duì)照，差異顯著。溶液濃度為15%～20%時(shí)，SOD活性不再升高，達(dá)到最大；濃度高于20%時(shí)，SOD活性呈下降趨勢(shì)，差異達(dá)到顯著性水平（圖1A）。104005在各溶液濃度脅迫下的SOD活性均高于其他3個(gè)品種（系），可見104005的抗旱性較強(qiáng)于其他3個(gè)品種（系）。不同PEG6000溶液濃度處理對(duì)白菜型春油菜的POD、CAT活性變化較大，均達(dá)到顯著性水平（圖1B、C），變化趨勢(shì)與SOD變化趨勢(shì)相似，且在一定溶液濃度范圍內(nèi)，白菜型春油菜抗氧化系統(tǒng)酶活性變化與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，可以區(qū)別不同品種（系）抗旱性強(qiáng)弱。

2.3 白菜型春油菜膜滲透性及膜損傷對(duì)PEG脅迫的響應(yīng)

2.3.1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)PEG脅迫的響應(yīng) 隨著PEG6000溶液濃度升高，4個(gè)品種（系）白菜型春油菜SPr含量變化均較大（圖2A），差異顯著。在0%～15%濃度范圍內(nèi)，SPr含量隨濃度升高而增加，油菜細(xì)胞通過(guò)SPr含量升高調(diào)整滲透勢(shì)促進(jìn)吸水，維持細(xì)胞正常狀態(tài)。在20%濃度時(shí)SPr含量達(dá)到峰值，超過(guò)20%時(shí)，含量下降，差異達(dá)到顯著性水平，此時(shí)已超過(guò)白菜型春油菜細(xì)胞抵御干旱的耐受程度。其中，104005變化程度明顯高于其他3個(gè)品種（系），最大變化值為60 mg/g；124220-1變化相對(duì)最小、最大變化值為50 mg/g。

表1 PEG6000溶液處理對(duì)白菜型春油菜幼苗成苗率、苗高及相對(duì)活力指數(shù)的影響Table 1 Effects of PEG6000 solution treatments on seedling survival rate, seedling height and relative vigor index of spring rapeseed（B. campestris L.）

不同PEG6000溶液濃度（0%～20%）下，4個(gè)品種（系）白菜型春油菜Pro含量明顯升高（圖2B），達(dá)到顯著性水平。20%濃度時(shí)4個(gè)品種白菜型春油菜Pro含量變化最明顯，變化值最大，達(dá)到峰值；當(dāng)溶液濃度高于25%時(shí)，Pro含量下降明顯，達(dá)到顯著性水平，該干旱脅迫程度超過(guò)白菜型春油菜幼苗承受能力，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞。其中，104005在各濃度處理中上升幅度最明顯，最大變化值達(dá)到50 μg/g。

隨著PEG6000溶液濃度升高，4個(gè)品種（系）白菜型春油菜SS含量呈上升趨勢(shì)，與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，變化達(dá)到顯著性水平（圖2C）。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加并積累，其中，104005在各濃度處理上變化最大，SS含量呈上升趨勢(shì)，最大變化值達(dá)到45 μg/g；124220-1變化趨勢(shì)與104005變化趨勢(shì)相似，變化值相對(duì)最小，最大變化值為36 μg/g。20%濃度處理時(shí)，不同品種（系）白菜型春油菜SS含量差異顯著，此濃度可作為白菜型春油菜抗旱性研究適宜的濃度水平，應(yīng)用于實(shí)際工作。

表2 PEG6000溶液處理對(duì)白菜型春油菜幼苗主根長(zhǎng)及單株鮮重的影響Table 2 Effects of PEG6000 solution treatments on seedling main root length and fresh weight per plant of spring rapeseed（B. campestris L.）

圖1 PEG6000溶液處理對(duì)白菜型春油菜抗氧化酶活性的影響Fig. 1 Effects of PEG6000 solution treatments on antioxidant enzyme activity of spring rapeseed（B. campestris L.）

2.3.2 MDA對(duì)PEG脅迫的響應(yīng) MDA是細(xì)胞質(zhì)膜過(guò)氧化產(chǎn)物，植物細(xì)胞遭受逆境脅迫時(shí)，其含量可反映膜系統(tǒng)過(guò)氧化損傷的程度。4個(gè)品種（系）白菜型春油菜MDA含量均隨PEG6000溶液濃度上升呈上升趨勢(shì)（圖2D），呈正相關(guān)關(guān)系，達(dá)到顯著性水平。124220-1在各濃度處理上變化最大，相較其他3個(gè)品種（系）對(duì)PEG6000溶液更敏感，而104005相對(duì)較遲鈍，變化值小于其他3個(gè)品種（系）。

3 討論

遭受干旱脅迫時(shí)，作物根系首先作出響應(yīng)，進(jìn)而影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)建成［13］，產(chǎn)量亦受到影響。根系是作物吸收水分、運(yùn)輸養(yǎng)分及物質(zhì)合成、同化、轉(zhuǎn)化的主要器官［4］，研究作物根系與抗旱性的關(guān)系具有重要意義。作物遺傳育種領(lǐng)域以種子早期萌發(fā)指標(biāo)篩選抗旱材料的方法已得到廣泛應(yīng)用［14-18］，根系的深度、根粗、根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)等指標(biāo)與植物抗旱性強(qiáng)弱具有相關(guān)性，根系越發(fā)達(dá)，植物抗旱性越強(qiáng)。本研究以PEG6000溶液模擬干旱脅迫，研究4個(gè)品種（系）白菜型春油菜芽期幼苗形態(tài)特征及生理生化的變化，結(jié)果表明，苗高、主根長(zhǎng)、單株鮮重、相對(duì)活力指數(shù)等早期指標(biāo)隨PEG脅迫程度增強(qiáng)而加劇，其中強(qiáng)抗旱性品種（系）各指標(biāo)下降程度均小于抗旱性弱品種（系）。相對(duì)活力指數(shù)、苗高等指標(biāo)可作為衡量抗旱性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，其他指標(biāo)可作為抗旱性篩選的輔助指標(biāo)［19］，篩選出品系104005抗旱性強(qiáng)于其他3個(gè)品種（系）。

干旱脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)最先反應(yīng)，清除細(xì)胞內(nèi)由于干旱產(chǎn)生的大量過(guò)氧化自由基。植物體內(nèi)的活性氧自由基具有雙重性作用［20］。植物遭受外界干旱、寒冷等逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)最先反應(yīng)，能清除細(xì)胞內(nèi)由于外界脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧自由基的氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基同時(shí)也是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)物質(zhì)，同時(shí)在脅迫信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，使植物對(duì)逆境脅迫做出響應(yīng)。逆境脅迫下，在植物細(xì)胞耐受范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基可被抗氧化酶系統(tǒng)清除，超出這一范圍即細(xì)胞內(nèi)氧自由基積累到一定程度，抗氧化酶系統(tǒng)不能完全清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的自由基，即會(huì)造成細(xì)胞氧化損傷，此時(shí)過(guò)量活性氧自由基亦可作為信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)誘發(fā)植物體內(nèi)產(chǎn)生與抗旱相關(guān)蛋白質(zhì)及相關(guān)基因表達(dá)，以抵御干旱逆境［21-23］。SPr、SS、Pro是植物體內(nèi)適應(yīng)干旱、寒冷、高溫、鹽漬等逆境脅迫過(guò)程中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過(guò)增加和積累含量提高細(xì)胞保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起保護(hù)作用，使其能在外界處于干旱逆境中繼續(xù)吸水，以維持植物體細(xì)胞的正常形態(tài)及正常生長(zhǎng)發(fā)育，增加植物干旱耐受力。細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)穩(wěn)定性是植物細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，逆境脅迫中植物細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性（通透性及流動(dòng)性）是植物抵御逆境能力的體現(xiàn)。干旱、低溫等逆境脅迫破壞細(xì)胞質(zhì)膜的分子結(jié)構(gòu)及功能，使植物細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換發(fā)生改變，其中細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲、胞外物質(zhì)自由進(jìn)出細(xì)胞是細(xì)胞膜系統(tǒng)破壞的表現(xiàn)，植物生長(zhǎng)發(fā)育受到逆境影響。植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基主要攻擊膜系統(tǒng)，膜系統(tǒng)損傷的主要產(chǎn)物是MDA。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)測(cè)定細(xì)胞MDA含量評(píng)價(jià)植物抵御逆境的能力［24］。本研究結(jié)果表明，隨著PEG脅迫濃度提高，MDA含量升高，細(xì)胞質(zhì)膜過(guò)氧化增強(qiáng)，其中104005升高的程度最低，抗逆性強(qiáng)于其他3個(gè)品種（系）。

圖2 PEG6000溶液處理對(duì)白菜型春油菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及MDA含量變化Fig. 2 Effects of PEG6000 solution treatments on seedling osmoregulation and MDA content of spring rapeseed（B. campestris L.）

4 結(jié)論

本研究以不同濃度PEG6000溶液模擬干旱脅迫，研究其對(duì)4個(gè)品種（系）白菜型春油菜芽期根系特征的影響，發(fā)現(xiàn)成苗率、主根長(zhǎng)、苗高、單株鮮重隨溶液濃度升高逐漸下降，相對(duì)活力指數(shù)亦下降，其中，苗高及相對(duì)活力指數(shù)變異最大，各品種（系）變異系數(shù)均大于31%。抗氧化酶活性隨溶液濃度呈先升高后降低趨勢(shì)，在15%濃度時(shí)活性最高，高于此濃度活性下降；SS、MDA含量隨PEG6000溶液濃度升高而增加，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（SPr、Pro）呈先升后降趨勢(shì)。綜合相對(duì)活力指數(shù)及生理生化指標(biāo)可知，15%～20% PEG6000溶液濃度時(shí)，各品種（系）白菜型春油菜相對(duì)活力指數(shù)在50%～60%之間，也是抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，可作為模擬水分脅迫抗旱性研究的最適濃度，并篩選到抗旱性白菜型春油菜品系104005。