新疆肥胖人群尿液代謝輪廓分析

阿麗葉古麗·艾皮熱，克力木·阿不都熱依木，凱賽爾·艾則孜，李贊林2,，艾克拜爾·艾力2,

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆 烏魯木齊，830001；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院普外微創(chuàng)研究所;3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院微創(chuàng)、疝和腹壁外科)

肥胖癥是體內(nèi)熱量攝入長期超過消耗量導(dǎo)致體內(nèi)脂肪堆積過多或/和分布異常的復(fù)雜慢性代謝性疾病，與環(huán)境(包括社會與文化)、遺傳、生理、代謝、飲食、行為及心理等多種因素有關(guān)，可引發(fā)糖尿病、高脂血癥、冠心病、高血壓、脂肪肝、睡眠呼吸暫停低通氣綜合征、慢性腎功損害、內(nèi)分泌功能紊亂等多種嚴(yán)重代謝障礙性并發(fā)癥與疾病，從而嚴(yán)重威脅患者身心健康，甚至影響壽命。超重及肥胖者隨著BMI的增加，肥胖相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，而且死亡率隨體重增加呈幾何級數(shù)升高。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及生活水平的提高，不論發(fā)達(dá)國家抑或發(fā)展中國家，肥胖癥發(fā)病率正在逐年上升，已成為全球蔓延速度最快、最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1]。在美國，約1/3人口為超重，1/3人口為肥胖，肥胖僅次于過度吸煙排在可預(yù)防致死因素的第二位，每年直接或間接花在肥胖治療上的費(fèi)用超過1千億美元[2]。肥胖癥已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為影響人類健康的五大危險(xiǎn)因素之一。在國內(nèi)情況同樣不容樂觀，中國疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行的中國慢性病調(diào)查顯示，2007年與2010年中國成年人(18～64歲)超重的患病率分別為26.6%與30.6%，肥胖的患病率分別為7.7%與12.1%[3]。因此，如何有效控制體重，控制與減少肥胖及肥胖并發(fā)癥的發(fā)生，已成為倍受關(guān)注的話題。開展與肥胖相關(guān)的課題研究也成為了新世紀(jì)的迫切任務(wù)。新疆是維吾爾族、漢族等多民族聚居地，地理環(huán)境與自然生態(tài)條件特殊，民族生活風(fēng)俗習(xí)慣與飲食文化獨(dú)特，動物高熱量、高脂肪、高蛋白飲食相當(dāng)普遍，因此在新疆地區(qū)肥胖更為高發(fā)。Song等的流行病學(xué)調(diào)查顯示，在新疆維吾爾族人群總肥胖率高達(dá)23.57%，男、女性分別為18.12%與29.03%，明顯高于全國平均水平[4]。目前針對新疆地區(qū)少數(shù)民族肥胖癥的發(fā)病機(jī)理、生物相關(guān)標(biāo)志物、早期預(yù)警系統(tǒng)建立等方面的研究較少。采用疾病代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等現(xiàn)代科技手段深入研究新疆少數(shù)民族肥胖癥高發(fā)原因，具有重要的科學(xué)意義與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，能對生物流體中的代謝產(chǎn)物與代謝中間物進(jìn)行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)由疾病過程引起的代謝異常，幫助人們更好地理解病變過程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑，還有助于疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及輔助臨床診斷的目的[5-6]。使用代謝組學(xué)技術(shù)研究肥胖的發(fā)生發(fā)展更具備宏觀性、動態(tài)性與準(zhǔn)確性。從而了解到肥胖及其相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中代謝物質(zhì)與特征性蛋白表達(dá)的變化規(guī)律及其相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的異常代謝路徑，并闡明與疾病相關(guān)的分子機(jī)制。但性別、年齡、飲食、生活方式及地域多樣性等生理與環(huán)境因素嚴(yán)重影響代謝組學(xué)結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性[7-9]。然而新疆作為多民族地區(qū)，民族傳統(tǒng)與飲食文化多種多樣，在進(jìn)行疾病代謝組學(xué)的研究過程中，如不考慮族別因素，會在代謝組學(xué)研究結(jié)果中引入大量假陽性的結(jié)果，嚴(yán)重干擾相關(guān)研究結(jié)果的可靠性?；谝陨显?，本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)分析技術(shù)，系統(tǒng)研究新疆主要世居民族之一——維吾爾族健康正常體重、超重與肥胖人群尿液代謝輪廓，觀察新疆維吾爾族正常、超重與肥胖人群尿液樣本中代謝物，并發(fā)現(xiàn)與鑒定差異代謝物；進(jìn)而發(fā)現(xiàn)肥胖與正常體重人群相比發(fā)生的根本的代謝改變。由于肥胖導(dǎo)致的機(jī)體代謝改變也可能是肥胖相關(guān)慢性代謝性疾病(代謝綜合征、糖尿病等)形成與發(fā)展的原因，因此也可能找到肥胖相關(guān)慢性代謝疾病早期的生物標(biāo)志物，為肥胖及其相關(guān)慢性疾病的早期發(fā)現(xiàn)與早期防治提供科學(xué)依據(jù)及新的思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集與儲存 研究對象均為2016年1月至2017年12月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院體檢中心健康體檢與減重外科中心住院治療的維吾爾族成人作為受試者，20～60歲。按照WHO肥胖分級標(biāo)準(zhǔn)將受試者分為三組，即正常體重組(18.5 kg/m2≤BMI<25 kg/m2)，超重組(25 kg/m2≤BMI<30 kg/m2)與肥胖組(BMI≥30 kg/m2)。為排除混雜因素，剔除惡性腫瘤、急性炎癥、創(chuàng)傷、繼發(fā)性肥胖、妊娠、嚴(yán)重心肺肝腎器質(zhì)性疾病、精神病及有減肥手術(shù)史、服用對脂代謝有影響藥物的患者。收集空腹晨尿30 mL，于-80℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 N，O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(98%)；三甲基氯硅烷、甲氧基胺鹽酸鹽(98%)；吡啶(分析純)，十二酸(色譜純)。

1.3 GC-MS分析樣品前處理 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]處理尿樣，取200 μL尿樣加20 μL尿素酶混懸液(相當(dāng)于100 U尿素酶)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵化1 h，降解尿液中的尿素。加1.7 mL甲醇，10 000 g離心10 min(4℃)。取1.5 mL上清液，用氮吹儀50℃下吹干溶劑。干燥后的樣品中加入100 μL甲苯溶解混勻，再用氮吹儀50℃下吹干20 min干燥。干燥樣品中加入50 μL甲氧胺60℃烤箱中反應(yīng)2 h。加入7 μL (5 mg/mL)月桂酸對照溶液(內(nèi)標(biāo)物)。樣品中快速加入100 μL MSTFA/TCMS (99:1)，60℃烤箱中反應(yīng)1 h。樣品降溫至常溫，移入GC瓶中待測。實(shí)驗(yàn)用樣品取一定量漩渦混勻，再取混勻后的前處理樣品200 μL，按樣品的制備方法制備。每10個(gè)樣品后放一個(gè)前處理樣品檢測。180個(gè)尿樣需要18個(gè)前處理樣品檢測。

1.4 GC-MS分析條件 色譜條件[11]:Agilent HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)，載氣：高純氦氣(純度：99.999%)，柱流量1.0 mL/min。程序：升溫條件初始柱溫60℃，保留2 min，以10℃/min升溫至280℃，維持10 min。進(jìn)樣口溫度為280℃，接口溫度280℃，進(jìn)樣量為 0.2 μL，分流模式：不分流。質(zhì)譜條件：電離方式EI，碰撞能量為70 ev，離子源溫度230℃，溶劑延遲時(shí)間為6.2 min，掃描方式：全掃描：40～600 m/z。

1.5 CG-MS 數(shù)據(jù)分析 通過安捷倫定性分析軟件Masshunter的Find by Chromatogram Deconvolution功能查找未知化合物，歸類，將原始數(shù)據(jù)的“.d”格式轉(zhuǎn)換為“.cef”，對總離子流圖進(jìn)行特征離子提取，導(dǎo)入MPP軟件(Agilent G3835AA MassHunter Mass Profiler Professional)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，得出的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，利用SIMCA-P 進(jìn)行數(shù)據(jù)分型，利用NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定代謝標(biāo)記物。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料 肥胖組、超重組的BMI、腰圍、舒張壓高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；肥胖組高密度脂蛋白低于超重組與正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；3組患者性別、年齡、收縮壓、血糖、低密度脂蛋白、游離脂肪酸水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組患者臨床資料的比較

續(xù)表1

2.2 GC-MS結(jié)果

2.2.1 質(zhì)量控制 選擇內(nèi)標(biāo)物的特征離子峰進(jìn)行分析，計(jì)算特征離子峰的保留時(shí)間偏移，峰面積偏差與離子精確質(zhì)量數(shù)漂移。結(jié)果顯示，特征峰保留時(shí)間偏移<0.1 min，峰面積的RSD<15%，精確質(zhì)量數(shù)漂移值<7 ppm。由此可見，在代謝數(shù)據(jù)采集過程中，GC-MS系統(tǒng)穩(wěn)定，所采集數(shù)據(jù)較為可靠。

2.2.2 PCA分析 從各組數(shù)據(jù)的PCA分析圖可知，肥胖組、超重組、正常組的尿代謝物得到了較好的分離，且各組內(nèi)聚合度較好。見圖1、圖2。

2.2.3 MPP分析差異代謝物 MPP軟件分析肥胖組、超重組、正常組所有樣品，共檢測到3 995個(gè)化合物，進(jìn)行組間出現(xiàn)概率>75%過濾篩選后得234個(gè)化合物；再進(jìn)行組內(nèi)出現(xiàn)概率100%篩選，得到54個(gè)化合物。One-Way ANOVA分析，組間進(jìn)行多重比較，找到P<0.05的差異變量化合物16個(gè)。將化合物帶回Masshunter 軟件，篩選出峰形較好、差異顯著的化合物，利用NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對可能的標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，匹配度大于80%的鑒定結(jié)果較為可信。見表2。

表2 差異代謝物鑒別結(jié)果

3 討 論

代謝組學(xué)從分子水平對代謝途徑中的終端產(chǎn)物進(jìn)行研究，在發(fā)現(xiàn)診斷疾病、評估療效的新標(biāo)志物及探究制定新的個(gè)體化治療方案等方面均存在顯著優(yōu)勢[12]，在疾病代謝組學(xué)研究中，眾多內(nèi)部與外部因素均影響生物樣本中代謝物的組成與含量，導(dǎo)致代謝組學(xué)研究結(jié)果存在極大的可變性。飲食習(xí)慣、外界壓力、身體健康狀態(tài)、參加鍛煉頻率與強(qiáng)度等外部生理?xiàng)l件在動物實(shí)驗(yàn)中可通過嚴(yán)格控制，得到最大化的降低或消除這些因素的影響[13-14]，但針對人進(jìn)行疾病組學(xué)研究，此法并不適用，導(dǎo)致相關(guān)代謝組學(xué)研究結(jié)果存在大量不可預(yù)測的變量。Lenz等[15]系統(tǒng)研究了英國與瑞典兩個(gè)國家健康人群的尿液輪廓，發(fā)現(xiàn)由于兩個(gè)國家間飲食傾向與文化的不同，人群尿液樣本輪廓存在較大差異，如氧化三甲胺在瑞典健康人群尿液中含量中明顯高于英國健康人群；Dumas等[16]系統(tǒng)考察了日本、芝加哥與中國的健康人群，證實(shí)了三個(gè)國家健康人群由于飲食、基因及腸道微生物等因素導(dǎo)致尿液輪廓出現(xiàn)差異。表明民族文化與傳統(tǒng)的差異會導(dǎo)致不同族別人群尿液樣本中代謝物的種類與含量存在差異，嚴(yán)重干擾相關(guān)疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與鑒定。因此在對新疆地區(qū)高發(fā)病進(jìn)行研究時(shí)，應(yīng)充分考慮族別對疾病代謝組學(xué)研究產(chǎn)生的影響。

尿液中代謝物的波動不僅能反映機(jī)體整體代謝的特征，還可能是局部組織或器官功能異常的外在表現(xiàn)，因此，通過對尿液中存在的差異性代謝產(chǎn)物的檢測可推測人體內(nèi)的代謝過程。近年，對尿液代謝相關(guān)研究的報(bào)道較多，更有涉及腎細(xì)胞癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌等肥胖相關(guān)腫瘤性疾病，以及高血壓、糖尿病、睡眠呼吸暫停癥狀等肥胖相關(guān)疾病[17-21]。而且GC-MS聯(lián)用技術(shù)具備較為完善的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，操作簡便，具有較強(qiáng)的分離分析能力，已得到廣泛應(yīng)用[22-23]。Gompertz等應(yīng)用氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析糖尿病患者尿液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)a-羥基異戊酸、a-酮異戊酸、a-酮異己酸、a-酮b-甲基戊酸、b-羥基丁酸等升高顯著，從而利用這5種有機(jī)酸聯(lián)合進(jìn)行糖尿病患者的初始篩查與診斷。Yuan等還分析了28例2型糖尿病青年男性患者的單純性肥胖血液與尿液的代謝組學(xué)研究及26例健康人群尿中的有機(jī)酸譜，得到4種有機(jī)酸為2型糖尿病的標(biāo)志物，也可對糖尿病患者進(jìn)行明確診斷。那么使用代謝組學(xué)技術(shù)研究肥胖的發(fā)生發(fā)展就更具備宏觀性、動態(tài)性與準(zhǔn)確性。

本研究中我們通過GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)檢測肥胖、超重及健康對照組維吾爾族人群的尿液樣本，共鑒定出葡萄糖、阿拉伯糖、L-蘇糖酸、2-酮基-L-古龍酸、羥基丙酸、丙氨酸、甘油酸、檸蘋酸、乳糖、尿酸、乙醇酸、赤蘚糖醇、甘氨酸、棕櫚酸單甘油酯、丁酸、纖維二糖等16種差異性代謝產(chǎn)物，其代謝途徑主要涉及糖脂代謝、氨基酸代謝、能量代謝等。

3.1 糖脂代謝 本研究結(jié)果表明，在差異代謝物中葡萄糖依然是肥胖患者尿液中變化最為顯著的代謝標(biāo)志物，作為生物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的重要物質(zhì)之一，它參與了眾多代謝途徑，包括脂代謝、能量代謝、氨基酸代謝等。肥胖患者體內(nèi)由于存在胰島素抵抗與分泌不足的情況，往往導(dǎo)致糖酵解減慢及血、尿中葡萄糖水平的升高。在與葡萄糖相關(guān)的代謝途徑中，雖然糖酵解/糖異生途徑最為重要，但作為重要的功能來源其參與了脂代謝、能量代謝等多種途徑，因此綜合分析才能得到更全面的信息。本研究發(fā)現(xiàn)，在超重及肥胖患者的尿液中均存在葡萄糖含量明顯升高的特點(diǎn)，并伴隨著能量代謝標(biāo)志物及氨基酸代謝物的差異。

3.2 氨基酸代謝 本研究發(fā)現(xiàn)在超重及肥胖患者中，有甘氨酸、丙氨酸等氨基酸代謝物存在差異，表明肥胖患者體內(nèi)發(fā)生氨基酸代謝的紊亂。氨基酸代謝差異可能與多種因素有關(guān)，如飲食習(xí)慣、生活環(huán)境等。其不僅是重要的營養(yǎng)物質(zhì)，更參與了多種神經(jīng)遞質(zhì)的功能，如甘氨酸、丙氨酸是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，經(jīng)谷氨酞胺轉(zhuǎn)變后成為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。丙氨酸還是糖代謝與免疫系統(tǒng)的重要氨基酸。

3.3 能量代謝 本研究鑒定出與能量代謝有關(guān)的化合物主要有乳酸、丙氨酸。乳酸是糖酵解過程中由葡萄糖無氧降解而成。超重及肥胖患者尿液中的乳酸含量均高于于正常組，表明超重及肥胖患者存在有氧代謝障礙與無氧酵解失衡，出現(xiàn)了能量代謝的紊亂。此外，尿中氨基酸變化多系肝臟葡萄糖糖異生引起的，本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者尿液中甘氨酸含量發(fā)生了變化，也可能由肝臟葡萄糖糖異生引起。丙氨酸參與了多種代謝途徑，也是能量來源之一。尿液中丙氨酸含量增加，亦表明能量代謝水平發(fā)生了變化。由于影響代謝的因素很多，肝、腎、腦、肌肉、紅細(xì)胞等組織器官均參與其中，代謝物的代謝途徑多樣，因此，從整體來看，肥胖癥患者的能量代謝水平降低。在本研究中維吾爾族肥胖患者尿液中丙氨酸含量上升，表明葡萄糖的正常代謝被抑制。

丁酸是一種四碳短鏈天然脂肪酸，而短鏈脂肪酸既是體內(nèi)重要的能量來源，由腸道微生物對食物中的碳水化合物發(fā)酵所產(chǎn)生的，而且它通過相應(yīng)的受體調(diào)節(jié)基因表達(dá)，通過腸-腦軸調(diào)節(jié)能量平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者尿液中丁酸含量發(fā)生了一定的下調(diào)。此結(jié)果與吳水蕓[24]的報(bào)道結(jié)果一致。赤蘚糖醇是一種糖醇，由酵母菌發(fā)酵而成，也存在于一些水果及發(fā)酵食品中，幾乎不被人體腸道菌群的細(xì)菌消耗；因此過量的赤蘚糖醇在尿液中未經(jīng)修飾地排出[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超重及肥胖患者尿液中赤蘚糖醇含量較正常體重組降低，表明超重及肥胖患可能菌群代謝發(fā)生了改變。

上述可見，肥胖癥患者體內(nèi)三大代謝均存在異常，某一代謝途徑的改變引起關(guān)聯(lián)途徑的變化，從而形成惡性循環(huán)，最終造成累及全身的代謝紊亂綜合征。在此后的研究中應(yīng)重點(diǎn)揭露該代謝產(chǎn)物與肥胖并發(fā)癥之間的確切關(guān)系，以便為治療與預(yù)防肥胖癥及其相關(guān)并發(fā)癥提供理論依據(jù)。