基于核磁共振氫譜的超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中脂肪酸含量差異分析

蘇美丞，賈 曼，張 霞，譚冬飛，張清陽，尹增浩，王少雷，陳 剛*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

營養(yǎng)價值是評價食品品質(zhì)的指標(biāo)之一，營養(yǎng)物質(zhì)的含量、種類、特性則是評價食品營養(yǎng)價值的重要依據(jù)。牛乳產(chǎn)品因其豐富的營養(yǎng)價值受到人們的喜愛，同時也被列入許多國家的膳食推薦指南，在我國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會2016年發(fā)布的《中國居民膳食指南》中，推薦成人每日乳制品攝入量為300 g。芬蘭、澳大利亞、瑞士、加拿大等國家推薦的每日乳制品攝入量為500～750 mL[1]。牛乳中含有人體所需的六大營養(yǎng)成分（碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素和水），其中，三大產(chǎn)能營養(yǎng)成分（碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)）在牛乳中的含量為10%～12%，僅次于水（含量約為87%）。

脂肪酸是脂肪的主要組成成分，由C、H、O 3 種元素構(gòu)成，按照飽和度可將脂肪酸分為3 類：飽和脂肪酸（碳鏈不含雙鍵）、單不飽和脂肪酸（碳鏈只含有1 個雙鍵）和多不飽和脂肪酸（碳鏈含有2 個及2 個以上雙鍵）；而根據(jù)碳鏈上雙鍵出現(xiàn)的位置，又將這些不飽和脂肪酸分為n-3、n-6系等不飽和脂肪酸[2]。脂肪酸與許多疾病的發(fā)生有著密切關(guān)聯(lián)，如飽和長鏈脂肪酸會增加低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇水平，進(jìn)而增加患動脈粥樣硬化和心血管疾病的風(fēng)險[3]。不飽和脂肪酸可以降低Ⅱ型糖尿病人的血糖水平[4]，降低高膽固醇患者中血清總膽固醇含量；經(jīng)常攝入富含單不飽和脂肪酸的食物可以調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)心臟、降低動脈損傷的風(fēng)險[5]。多不飽和脂肪酸還具有改善內(nèi)分泌、抗血栓、延緩大腦和皮膚衰老、促進(jìn)生長發(fā)育的作用[6-9]。

牛乳中含有約400 種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸在乳脂中占比較低，乳中脂肪酸的組成受飼料、哺乳期、季節(jié)、奶牛品種的影響[10-12]。加工工藝也可能導(dǎo)致牛乳產(chǎn)品中脂肪酸發(fā)生改變。崔婧[13]利用高分辨質(zhì)譜對復(fù)原乳和超高溫滅菌乳的脂質(zhì)組成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)15 種脂質(zhì)在超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中具有顯著差異（P＜0.001），其中包含大部分中長鏈飽和脂肪酸和少量短鏈脂肪酸及單不飽和脂肪酸，這些變化極有可能與溫度相關(guān)。魏小豹等[14]對食用油中的脂肪酸進(jìn)行研究，也證實(shí)脂肪酸含量和種類的變化與加熱溫度有關(guān)，主要表現(xiàn)為飽和脂肪酸含量增加，不飽和脂肪酸含量減少，以及中、短鏈和環(huán)狀脂肪酸種類增加。

脂肪酸是一種熱敏性物質(zhì)，受外界環(huán)境（光照、溫度、奶牛飼養(yǎng)條件等）的影響，脂肪酸在食品中的分布和含量會有所變化，牛乳加工過程中，預(yù)熱、滅菌、噴霧干燥等過程均會對牛乳有不同程度的加熱，會導(dǎo)致牛乳中不飽和脂肪酸等發(fā)生氧化、降解[28]。目前，生鮮乳、巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳脂肪酸含量的差異檢測分析研究較多，而超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中的研究較少。脂肪酸對維持生命機(jī)能、保持身體健康具有重要作用[29]，因此，對超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中的脂肪酸進(jìn)行研究能夠?yàn)椴煌庸すに嚺Ｈ橹械闹舅岷亢头植继峁?shù)據(jù)支持，同時能為牛乳脂肪酸的品質(zhì)評價及牛乳產(chǎn)品的營養(yǎng)評價提供參考，尤其是對高膽固醇患者等有特殊需求的人群有重要意義。

本研究利用1H NMR技術(shù)，對超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中的脂肪酸進(jìn)行研究，闡明2 種產(chǎn)品中脂肪酸的含量和種類，為牛乳的脂肪酸品質(zhì)評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇北京各大超市售賣的超高溫滅菌乳和全脂乳粉，為保證實(shí)驗(yàn)具有代表性，選擇10 種品牌不同批次生產(chǎn)的樣品，每種樣品各收集10 份。樣品在分析前均在4 ℃、避光條件下保存。

氘代氯仿（CDCl3，氘代率99.8%，含體積分?jǐn)?shù)0.03%四甲基硅烷） 美國Cambridge Isotope Laboratories公司；甲醇（色譜純）、氯仿（色譜純）美國Thermo Fisher Scienti fic公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；BS 223S精密電子天平 華東醫(yī)藥有限公司；Advance Ⅲ 400 MHz核磁共振儀 德國Bruker公司；HN 200多功能氮吹儀濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Biofuge Stratos離心機(jī)美國Thermo Fisher Scienti fic公司；Vortex Genius 3渦旋混合儀 德國IKA公司；ST500核磁管 美國Norell公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

參考李強(qiáng)強(qiáng)等[25]建立的乳品脂質(zhì)1H NMR檢測技術(shù)，以蛋白質(zhì)含量3 g/100 mL為標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確稱量一定質(zhì)量乳粉溶于2 mL超純水中，渦旋10 min，使乳粉充分混勻，獲得復(fù)原乳，備用。

將1 mL超高溫滅菌乳（或復(fù)原乳）樣品、6 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶劑加入至15 mL玻璃離心管中；渦旋2 min，混勻后加入2 mL超純水，再渦旋2 min，混勻后放入離心機(jī)，4 ℃、2 000 r/min條件下離心20 min；將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一玻璃離心管中，氮吹至透明薄膜狀；加入1 mL氘代氯仿，渦旋復(fù)溶，轉(zhuǎn)移600 μL至核磁管中待測。

此時謝遜剛剛擊殺了海沙派、巨鯨幫等幾個慣常偷雞摸狗的幫會的老大，口稱他們品行不端，予以懲戒。這對于正直的張翠山來說，自是“行俠仗義”之所為。然而接下來謝遜卻又要對剩下的在場所有人下手，看來頗為不符大俠風(fēng)范，于是張翠山跳出來喝止了這一行為，并有了上述的對話。

1.3.2 數(shù)據(jù)采集與分析

使用400 MHz Bruker核磁共振儀進(jìn)行1H NMR數(shù)據(jù)采集，實(shí)驗(yàn)溫度298 K，脈沖序列為zg 30；采樣次數(shù)16 次，數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)64 000，譜寬8 233.70 Hz，采樣時間3.98 s，弛豫時間4 s，調(diào)諧增益50.80。

使用Topspin 3.60軟件對獲得的圖譜進(jìn)行處理，手動調(diào)節(jié)相位并校正基線，將內(nèi)標(biāo)物四甲基硅烷化學(xué)位移（δ）設(shè)置為0，用阿拉伯?dāng)?shù)字對各個峰進(jìn)行標(biāo)注并積分，對峰面積進(jìn)行歸一化處理。

將獲得的積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入Excel軟件，分別計算2 組數(shù)據(jù)（復(fù)原乳和超高溫滅菌乳）的組內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），剔除組內(nèi)差異大的積分?jǐn)?shù)據(jù)（RSD＜20%），并對處理后的積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行定量。

將各峰面積和脂肪酸含量導(dǎo)入SIMCA 14和SPSS 25軟件中進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

1.3.3 結(jié)果計算

用A1～A8、A9a、A9b和A10～A12表示1H NMR圖譜中各個峰的面積，根據(jù)1H NMR圖譜中峰面積與該峰的質(zhì)子數(shù)成正比，分別按公式（1）～（5）計算超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中亞麻酸、亞油酸、油酸、不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 1H NMR圖譜分析

以超高溫滅菌乳為例，樣品中提取的脂肪酸1H NMR圖譜如圖1所示。1H NMR圖譜上的信號峰代表牛乳中脂肪酸不同質(zhì)子的官能團(tuán)信息，圖譜中主要存在12 組信號峰，從高場到低場方向分別用數(shù)字1～12進(jìn)行標(biāo)注。以李強(qiáng)強(qiáng)[25]、李瑋[30-31]等對不同乳制品及食用油中脂質(zhì)的研究為參考，將2 種牛乳中的各個信號峰進(jìn)行脂肪酸質(zhì)子的官能團(tuán)歸屬分析（表1）。

表1 牛乳脂1H NMR圖譜中信號峰歸屬[25,30-31]Table 1 Assignment of signal peaks in 1H NMR spectra of milk lipids[25,30-31]

由圖1及表1可知：1號峰（δ0.85～0.91）和2號峰（δ0.92～0.98）分別代表飽和脂肪酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中末端甲基質(zhì)子和亞麻酸中的末端甲基質(zhì)子，二者共代表了牛乳中所有脂肪酸鏈的末端甲基質(zhì)子信號；3號峰（δ1.22～1.36）代表所有脂肪酸鏈上的亞甲基質(zhì)子；4號峰（δ1.55～1.65）和5號峰（δ1.65～1.70，三重峰）代表所有脂肪酸鏈上與羰基（-OCO-或COOH-）相隔1 個亞甲基基團(tuán)的亞甲基質(zhì)子；6號峰（δ1.92～2.11）代表脂肪酸鏈上與碳碳雙鍵（-C＝C-）相連的β位上的亞甲基質(zhì)子；7號峰（δ2.25～2.36）代表脂肪酸鏈上與羰基相鄰的亞甲基質(zhì)子；8號峰（δ2.36～2.42）代表脂肪酸鏈上與羰基相鄰的2 個亞甲基質(zhì)子；9號峰（δ2.74～2.84）代表亞麻酸和亞油酸中位于2 個碳碳雙鍵間的亞甲基質(zhì)子，其中δ2.78～2.84處的三重峰代表亞麻酸，δ2.74～2.78處的二重峰代表亞油酸；10號峰（δ4.10～4.34）和11號峰（δ5.23～5.31）分別代表脂肪酸甘油基團(tuán)上的亞甲基質(zhì)子和次甲基質(zhì)子；12號峰（δ5.31～5.40）代表所有不飽和脂肪酸中碳碳雙鍵上的質(zhì)子。

表2 超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中脂肪酸相對含量Table 2 Relative contents of fatty acids in UHT milk and reconstituted milk%

由表2可知，超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中不飽和脂肪酸相對含量最高，分別為（56.59±1.89）%、（56.19±2.34）%，亞麻酸相對含量最低，分別為（0.98±0.11）%、（0.90±0.04）%，亞油酸相對含量分別為（1.15±0.36）%、（1.11±0.36）%，油酸相對含量分別為（27.30±0.56）%、（26.78±0.78）%，飽和脂肪酸相對含量分別為（43.26±1.56）%、（43.81±2.34）%。2 種乳中各類脂肪酸的相對含量相近。

2.2 OPLS-DA和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)

對峰面積進(jìn)行OPLS-DA能夠獲得2 種乳的分類圖（圖2），從OPLS-DA結(jié)果可知，超高溫滅菌乳與復(fù)原乳能夠被區(qū)分開。根據(jù)變量投影重要性（variable importance in the project，VIP）分析，提取出對2 種乳分類具有重要影響（VIP＞1，VIP由軟件自動計算）的變量，其中，對2 種乳分類影響較大的變量為A9、A11、A1、A7、A3、A4、A6。A1代表飽和脂肪酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，A3、A4和A7代表所有脂肪酸，A6代表所有不飽和脂肪酸，A9代表亞麻酸和亞油酸，A11代表甘油基團(tuán)。

研究表明，中短鏈脂肪酸受溫度影響比長鏈脂肪酸明顯，多不飽和脂肪酸受溫度影響比飽和、單不飽和及雙不飽和脂肪酸明顯[14]。結(jié)合超高溫滅菌乳和乳粉的加工工藝分析，溫度可能是引起2 種乳中脂肪酸出現(xiàn)差異的主要原因。對于乳粉噴霧干燥過程，噴霧干燥進(jìn)風(fēng)口溫度為120～130 ℃，與超高溫滅菌溫度相近，脂肪酸的變化可能主要發(fā)生在此階段。受到第2次高溫加熱，牛乳中的脂肪酸組分和含量發(fā)生變化，導(dǎo)致復(fù)原乳中飽和脂肪酸相對含量比超高溫滅菌乳中略高，不飽和脂肪酸、亞麻酸、油酸和亞油酸相對含量比超高溫滅菌乳中略低，且亞麻酸相對含量具有顯著差異。在噴霧干燥過程中，不飽和脂肪酸可能發(fā)生氧化，生成飽和脂肪酸，也可能是長鏈脂肪酸降解形成新的中短鏈飽和脂肪酸。

2.3 營養(yǎng)學(xué)評價

根據(jù)超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中脂肪酸的差異，對2 種乳進(jìn)行初步營養(yǎng)學(xué)評價?？傮w來說，超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸相對含量相近，表明二者營養(yǎng)價值相近。超高溫滅菌乳中亞麻酸相對含量顯著高于復(fù)原乳，對高血脂、高膽固醇等人群有益；亞麻酸和亞油酸在體內(nèi)能夠代謝為花生四烯酸和二十二碳六烯酸，對提高記憶力、兒童大腦發(fā)育、肥胖人群有益。中短鏈脂肪酸水溶性大于長鏈脂肪酸，能夠從小腸被迅速吸收到門靜脈循環(huán)中，研究表明，飲食中攝入短鏈和中鏈脂肪酸對高血脂和患有營養(yǎng)不良吸收綜合征（如囊性纖維化）的患者有益[32-33]，復(fù)原乳中的中短鏈脂肪酸相對含量增加，可能對這些人群比較有益。

3 結(jié) 論

對超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中的脂肪酸含量差異進(jìn)行研究，結(jié)果表明：超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中各類脂肪酸相對含量相近，亞麻酸在2 種乳中相對含量最低，且超高溫滅菌乳中的相對含量顯著高于復(fù)原乳。此外，簡單分析了溫度對2 種乳中脂肪酸含量差異的影響，并對2 種牛乳進(jìn)行了初步營養(yǎng)學(xué)評價，為牛乳中脂肪酸的營養(yǎng)評價和研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。