開菲爾粒中乳酸菌的篩選與發(fā)酵特性

孫 敏，孫 玥，李 博，梅 俊*

（1.上海城建職業(yè)學(xué)院健康與社會(huì)關(guān)懷學(xué)院，上海 201415；2.上海城建職業(yè)學(xué)院城市食品安全研究所，上海 201415；3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；4.光明乳業(yè)股份有限公司，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436；5.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

開菲爾粒起源于高加索地區(qū)，在其蛋白質(zhì)、多糖構(gòu)成的骨架上棲息著乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種有益微生物，在牛乳或羊乳中培養(yǎng)時(shí)，能同時(shí)進(jìn)行乳酸、醋酸和乙醇發(fā)酵，制得一種黏稠且含醇、酸及少量CO2，稱之為開菲爾（Kefir）的發(fā)酵乳[1-2]。開菲爾在高加索地區(qū)、中東以及我國青藏高原地區(qū)較為流行[3-4]。地區(qū)間由于氣候和環(huán)境的差異導(dǎo)致開菲爾粒的微生物多樣性有所差別，掌握開菲爾粒的微生物多樣性差異和變化情況有利于掌握其發(fā)酵過程、產(chǎn)物及代謝機(jī)理等[5-6]。開菲爾粒中的乳酸菌是近些年來的研究熱點(diǎn)，從中分離到的乳酸菌主要有開菲爾乳桿菌（Lactobacillus ke firi）、開菲爾基質(zhì)乳桿菌（Lb. kefiranofaciens）、Lb. kefirgranum、類高加索酸奶乳桿菌（Lb. parakefir）、短乳桿菌（Lb. brevis）、干酪乳桿菌（Lb. casei）、副干酪乳桿菌（Lb. paracasei）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、乳脂鏈球菌（S.cremoris）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）等[7-9]。

開菲爾粒中的乳酸菌能夠產(chǎn)生乳酸和抗菌肽，抑制腐敗和病原微生物的生長(zhǎng)，為生產(chǎn)健康、安全的酸乳提供條件。本研究通過對(duì)開菲爾粒中的乳酸菌進(jìn)行分離，篩選具有抑菌活性的乳酸菌株，研究其發(fā)酵特性，評(píng)價(jià)所分離到的菌株作為酸乳發(fā)酵劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

開菲爾粒 西藏那曲某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923 昀冠（上海）生物科技有限公司；原料乳 光明乳業(yè)股份有限公司；培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；過氧化氫酶上海阿拉丁生化試劑有限公司；其他試劑均為分析純，由上海阿拉丁生化試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1冷凍干燥機(jī) 上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；Neofuge 13R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；LRH-250F恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TA-TX2質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；R/S plus旋轉(zhuǎn)流變儀 美國Brook field公司；pH計(jì)瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離和篩選

取開菲爾粒約1 g，加入9 mL生理鹽水，混勻后，進(jìn)行梯度稀釋，分別取不同稀釋梯度溶液100 μL涂布于MARS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，取單個(gè)菌落在MARS培養(yǎng)基上劃線純化。篩選到的乳酸菌菌株在37 ℃條件下發(fā)酵脫脂乳48 h后，離心（8 000 r/min、20 min、4 ℃），得到可能富含抑菌多肽的上清液，凍干后制成5 g/100 mL溶液，冷藏備用。

制備大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液（約7 （lg（CFU/mL））），分別取100 μL大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液涂布于各自培養(yǎng)基上，靜置30 min后，取5 μL上述上清液凍干粉溶液加于其上，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察是否有明顯抑菌圈。篩選出上清液能明顯抑制大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923生長(zhǎng)的乳酸菌菌株。

1.3.2 產(chǎn)抗菌肽乳酸菌的復(fù)篩

有機(jī)酸的排除[10]：將上清液凍干粉溶液的pH值調(diào)至6.0，用磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）作為對(duì)照組，對(duì)大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

過氧化氫的排除[11]：將上清液凍干粉溶液的pH值調(diào)至7.0，加入10 mg/mL過氧化氫酶，37 ℃水浴2 h，pH值調(diào)至6.0，以pH 6.0、未加過氧化氫酶處理的上清液凍干粉溶液作為對(duì)照，對(duì)大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 抗菌肽抑菌效果測(cè)定

將上清液凍干粉分別配成質(zhì)量濃度為200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.560、0.780、0.390、0.195 mg/mL的溶液。50 mL培養(yǎng)杯中加入18.8 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液、1 mL不同質(zhì)量濃度的凍干粉溶液和0.2 mL大腸桿菌ATCC25922或金黃色葡萄球菌ATCC25923菌液，測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處光密度（optical density，OD630nm）后37 ℃培養(yǎng)12 h，再次測(cè)定OD630nm。OD630nm增加值反映細(xì)菌的增長(zhǎng)量。

1.3.4 菌株抗熱能力測(cè)定

取0.2 mL篩選到的乳酸菌菌液，加入10 mL MARS液體培養(yǎng)基中，混勻后測(cè)定OD630nm。將菌液分別在40、50、60、80、100 ℃條件下水浴加熱10 min，取不同溫度處理的菌液與10 mL MARS液體培養(yǎng)基混合均勻后于37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，再次測(cè)定OD630nm。OD630nm增加值反映細(xì)菌的增長(zhǎng)量。

1.3.5 16S rDNA法鑒定菌株

將分離的菌株委托上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA鑒定。

1.3.6 酸乳的制備

根據(jù)楊爽等[12]方法，用本研究分離得到的菌株制備酸乳發(fā)酵劑，然后分別按照2、3、4 g/100 mL添加量加入到殺菌原料乳中，攪拌均勻后在42 ℃條件下發(fā)酵6 h，發(fā)酵完成后在室溫下保持30 min，轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱中后熟24 h，此時(shí)記為0 d。繼續(xù)在4 ℃冰箱中貯藏，在貯藏0、5、10、15、20、25、30 d時(shí)取樣檢測(cè)。

1.3.7 酸乳pH值測(cè)定

采用余萍等[13]的方法，取25.0 mL酸乳，高速離心均質(zhì)（5 000 r/min，1 min），混勻后，用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.8 酸乳滴定酸度測(cè)定

采用Sert等[14]的方法，取5 g酸乳樣品，置于三角瓶中，加入20 mL去離子水，滴2 滴酚酞溶液，搖勻后用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至微紅色，并且在30 s內(nèi)不褪色，記錄消耗0.1 mol/L氫氧化鈉的體積。滴定酸度（吉爾涅爾度）按式（1）計(jì)算。

式中：V為滴定時(shí)消耗的0.1 mol/L氫氧化鈉體積/mL；F為0.1 mol/L氫氧化鈉的校正系數(shù)；20為酸乳的稀釋倍數(shù)。

1.3.9 酸乳硬度測(cè)定

按照Saleh等[15]的方法，采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定。采用柱形探頭，其平端直徑25 mm；測(cè)試前探頭下降速率10 mm/s，測(cè)試速率1 mm/s，測(cè)試后探頭回程速率5 mm/s；測(cè)試距離10 mm；觸發(fā)力5 g。由質(zhì)構(gòu)特性曲線圖得出的最大壓縮力表示酸乳樣品的硬度（N）。

1.3.10 酸乳黏度測(cè)定

按照Wang等[16]的方法，采用旋轉(zhuǎn)流變儀，cc-25轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)子和圓筒空隙2.00 mm。在4 ℃條件下，以300 s內(nèi)剪切速率（γ）0～512 s-1獲取黏度曲線，讀取γ=100 s-1時(shí)的黏度（Pa·s）。

1.3.11 酸乳持水率測(cè)定

按照Feng Cuijiao等[17]的方法，準(zhǔn)確稱取15.0 g酸乳，置于離心管中，4 ℃條件下3 600 r/min離心15 min后倒掉上清液，測(cè)定殘余物的質(zhì)量。持水率按式（2）計(jì)算。

式中：m1為收集到的殘余物質(zhì)量/g；m2為酸乳樣品質(zhì)量/g。

1.3.12 酸乳脫水收縮率測(cè)定

按照袁祎琳等[18]的方法，將20.0 g未經(jīng)攪拌的酸乳樣品放置于Whatman No.1濾紙中，4 ℃條件下過濾2 h，用燒杯收集過濾出的乳清。脫水收縮率按式（3）計(jì)算。

式中：m1為收集到的乳清質(zhì)量/g；m2為酸乳樣品質(zhì)量/g。

1.3.13 酸乳感官評(píng)價(jià)

由15 名感官品評(píng)人員組成的評(píng)定小組對(duì)冷藏保存15 d的酸乳樣品進(jìn)行感官評(píng)定，對(duì)酸乳樣品的組織、色澤、氣味和口感進(jìn)行描述性評(píng)價(jià)，采用百分制評(píng)分法，參照Kim等[19]的方法制定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

表1 酸乳感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of yogurt

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌性乳酸菌的篩選

篩選出1 株能明顯抑制大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923生長(zhǎng)的乳酸菌株，其離心分離得到的上清液也能明顯抑制大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923的生長(zhǎng)。排除了有機(jī)酸和過氧化氫抑菌的影響（未列出結(jié)果），判定抑菌物質(zhì)為上清液中的抗菌肽。

由圖1可知，當(dāng)所篩選乳酸菌發(fā)酵上清液凍干粉質(zhì)量濃度大于6.250 mg/mL時(shí)，抑制大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923生長(zhǎng)的效果明顯。由文獻(xiàn)[20-22]可知，抗菌肽的最低抑制質(zhì)量濃度為1～100 μg/mL。所篩選乳酸菌株發(fā)酵上清液凍干粉對(duì)測(cè)試菌株的最低抑制質(zhì)量濃度與文獻(xiàn)相比較高，其原因可能是除了抗菌肽以外，還含有一定量的乳酸菌代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙酸等有機(jī)酸，以及培養(yǎng)基中的部分可溶性成分等。

2.2 乳酸菌株的抗熱能力

由圖2可知，加熱溫度40 ℃時(shí)測(cè)得菌液OD630nm為0.23。當(dāng)加熱溫度升高時(shí)，微生物存活率降低，其OD630nm也降低，當(dāng)加熱溫度達(dá)到60 ℃以上時(shí)OD630nm＜0.05，表明多數(shù)菌株已經(jīng)死亡，因此分離得到的乳酸菌對(duì)溫度較為敏感，推斷該乳酸菌株為嗜溫菌。

2.3 菌株的鑒定結(jié)果

將測(cè)序得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，得到該菌株為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。干酪乳桿菌可以促進(jìn)人體消化吸收、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高人體免疫力、抗癌和降血壓等，還可以賦予乳制品特殊的風(fēng)味[23-24]。干酪乳桿菌具有優(yōu)良的保健功能并且能夠在人體胃腸道內(nèi)比較穩(wěn)定地存活，被普遍應(yīng)用于功能性食品領(lǐng)域，特別是發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中，干酪乳桿菌常用于發(fā)酵酸乳和干酪制作或與其他乳酸菌種配合使用發(fā)酵酸乳。

2.4 酸乳pH值與滴定酸度

由圖3可知，所制得酸乳的pH值在冷藏0 d時(shí)為4.57～5.15，發(fā)酵劑添加量越大其pH值越低，同時(shí)，冷藏期間各樣品pH值呈下降趨勢(shì)，但在冷藏期內(nèi)pH值變化無明顯差異。

由圖4可知，酸乳冷藏期間滴定酸度變化與pH值基本對(duì)應(yīng)，發(fā)酵劑添加量越大，滴定酸度越大，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，滴定酸度也增加。

2.5 酸乳硬度與黏度

對(duì)于消費(fèi)者來講，酸乳硬度是一個(gè)非常重要的指標(biāo)。由圖5可知，發(fā)酵劑添加量越大，酸乳會(huì)產(chǎn)生更為致密的酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)，酸乳硬度明顯增加。酸乳發(fā)酵越充分，酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)彼此間或與水分間可以連接在一起，形成對(duì)酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的重排，因此，所形成的結(jié)構(gòu)越穩(wěn)固，硬度越大。

消費(fèi)者在食用酸乳之前一般先要進(jìn)行攪拌，為了模擬典型的消費(fèi)者食用方式，酸乳測(cè)定前需要進(jìn)行攪拌，并不會(huì)引起黏度損失[25]。由圖6可知，所制得酸乳的表觀黏度隨著發(fā)酵劑添加量的增加而增加，同時(shí)冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，其表觀黏度減小。

酸乳硬度和黏度的改變是由于酪蛋白形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的變化，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，酸乳的硬度和黏度就越大。本研究中，發(fā)酵劑添加量越大，所制得酸乳的硬度和黏度越大，可能是由于酸乳pH值低，形成了更緊密的酪蛋白三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在冷藏過程中，所有樣品的硬度和黏度呈略微下降趨勢(shì)，可能是由于蛋白三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞[26-27]。

2.6 酸乳持水率與脫水收縮率

脫水收縮性是對(duì)酸乳質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，牛乳中的蛋白質(zhì)形成凝膠時(shí)的收縮導(dǎo)致乳清分離，這對(duì)酸乳的質(zhì)量不利[28]。由圖7可知，發(fā)酵劑添加量增大可以明顯降低脫水收縮率，冷藏0 d時(shí)，發(fā)酵劑添加量4 g/100 mL酸乳的脫水收縮率為22.03%，而發(fā)酵劑添加量2 g/100 mL和3 g/100 mL酸乳的脫水收縮率均高于25%。在冷藏過程中，酸乳脫水收縮率均先下降后逐漸上升。

由圖8可知，冷藏0 d時(shí)，發(fā)酵劑添加量2 g/100 mL酸乳的持水率為62.60%，明顯低于其他酸乳樣品。所制得酸乳冷藏期間的持水率先上升后下降，其變化趨勢(shì)與脫水收縮率基本對(duì)應(yīng)。酸乳持水率與凝膠酪蛋白的持水能力有關(guān)，一般來講，持水率越高，酸乳凝乳的穩(wěn)定性就越高。發(fā)酵劑添加量越高，所制得酸乳具有更高的持水率，外觀表現(xiàn)為乳清析出量越少。脫水收縮性和持水性的產(chǎn)生是由于酪蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的弱化導(dǎo)致酪蛋白持水能力下降，使得與酪蛋白結(jié)合的水分析出。發(fā)酵劑中的乳酸菌可以改變pH值，使得酪蛋白膠束通過等電沉淀進(jìn)行聚合，在酸乳冷藏過程中，酪蛋白膠束被打斷，聚合度下降[29]。

2.7 酸乳感官評(píng)價(jià)結(jié)果

表2 不同添加量干酪乳桿菌發(fā)酵劑酸乳的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of yoghurt with different inoculums amounts of Lactobacillus casei

由表2可知，發(fā)酵劑添加量2、3、4 g/100 mL酸乳的感官評(píng)價(jià)總分分別為70.04、80.03和81.13，得分的差距主要體現(xiàn)在組織和口感方面。由于發(fā)酵劑添加量高，產(chǎn)生更多的乳酸，使得酪蛋白膠束通過等電點(diǎn)沉淀進(jìn)行聚合，形成致密的酪蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此具有更順滑的質(zhì)構(gòu)。在氣味方面，發(fā)酵劑添加量越多，滋氣味越好，更多的乳酸菌在發(fā)酵過程中可以更好地利用脂肪酸和氨基酸產(chǎn)生酯類、醇類、酸類等化合物，并在咀嚼時(shí)釋放[30]。發(fā)酵劑添加量對(duì)酸乳色澤影響較小，無明顯差異。總體來說，使用干酪乳桿菌發(fā)酵劑的酸乳經(jīng)過15 d冷藏后整體表現(xiàn)與商業(yè)酸乳仍存在差距，感官品評(píng)者在備注中表示口感不夠細(xì)膩柔和。

3 結(jié) 論

利用培養(yǎng)基分離開菲爾粒中的乳酸菌菌株，然后以大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923為抑菌對(duì)象進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，篩選具有抑菌效果的菌株。分離發(fā)酵上清液制備凍干粉，在排除有機(jī)酸和過氧化氫的影響后，初步判定抑菌物質(zhì)為上清液中的抗菌肽。未純化的抗菌肽質(zhì)量濃度大于6.250 mg/mL時(shí)，抑制大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923生長(zhǎng)的效果明顯，利用16S rDNA方法，初步鑒定該菌株為干酪乳桿菌。以干酪乳桿菌作為發(fā)酵劑，分別以發(fā)酵劑添加量2、3、4 g/100 mL發(fā)酵全脂乳，42 ℃發(fā)酵6 h再后熟24 h后，4 ℃冷藏0、5、10、15、20、25、30 d時(shí)分別測(cè)定理化指標(biāo)和進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果表明，發(fā)酵劑添加量越大，所制得酸乳的pH值、滴定酸度、硬度、黏度、持水率和脫水收縮性等指標(biāo)明顯更優(yōu)，優(yōu)于發(fā)酵劑添加量2 g/100 mL酸乳。但是在多數(shù)指標(biāo)上，發(fā)酵劑添加量3 g/100 mL和4 g/100 mL 2 組酸乳指標(biāo)無明顯差異，從成本出發(fā)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)宜使用干酪乳桿菌發(fā)酵劑添加量3 g/100 mL發(fā)酵酸乳。