長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG5在重度子癇前期患者胎盤中的表達(dá)及其通過(guò)miR-155/CXCR4對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響

楊志娟,張 媛,彭迎春,許洪梅,楊 洋,師增增

(1樂(lè)山市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,樂(lè)山 614000;2西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;3空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:87498009@qq.com)

子癇前期(preeclapmpsia,PE)是妊娠期常見(jiàn)特異性疾病,危及母兒安全[1],目前發(fā)病機(jī)制不清。PE時(shí),由于滋養(yǎng)細(xì)胞增殖異常、侵襲障礙、凋亡增加,螺旋動(dòng)脈重塑受損,引發(fā)后續(xù)病理性胎盤形成為主要學(xué)說(shuō)[2]。PE是多因素、多機(jī)制及多通路引起的疾病;因此了解滋養(yǎng)細(xì)胞功能相關(guān)影響因素,對(duì)探究PE病因具有一定意義。

近年來(lái)的相關(guān)研究顯示,部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)與PE相關(guān),能夠調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移[3]。lncRNA為長(zhǎng)度超過(guò)200 nt且不能編碼蛋白質(zhì)的一類非編碼RNA(ncRNA),能夠參與細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等過(guò)程,還可以多種方式調(diào)控同為ncRNA屬性的微小RNA(microRNA,miRNA),間接影響miRNA的靶基因發(fā)揮相關(guān)生理功能[4]。其中,lncRNA-SNHG5在黑色素瘤細(xì)胞中能夠通過(guò)對(duì)miR-155發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)作用,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制凋亡[5]。而miR-155與PE的相關(guān)性研究已較為深入,其在PE胎盤組織中病理性高表達(dá)[6];其靶基因CXCR4[7]在PE胎盤中病理性低表達(dá),且能夠影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性[8]。

因此,lncRNA-SNHG5是否與PE相關(guān),該因子作為上游因子能否對(duì)miR-155發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA作用,改變miR-155的表達(dá),抑制靶基因CXCR4從而減弱滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能,參與PE的發(fā)病,值得探究。通過(guò)本研究,希望可以初步探索PE的發(fā)病機(jī)制,為臨床對(duì)PE進(jìn)行診斷或治療提供理論基礎(chǔ);對(duì)患者、醫(yī)療機(jī)構(gòu)及社會(huì)具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 胎盤組織采集

30例重度子癇前期(sPE組)與30例正常產(chǎn)婦(正常組)胎盤組織均收集自2018年10月至2019年6月于樂(lè)山市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科住院首次接受剖宮產(chǎn)分娩的患者。納入標(biāo)準(zhǔn):所納入的兩組產(chǎn)婦既往均無(wú)糖尿病、心臟病、慢性高血壓、慢性腎炎、自身免疫疾病、血栓形成病癥、精神疾病、陰道或剖宮產(chǎn)分娩史、胎兒畸形和HELLP綜合征病史。sPE組按照第九版婦產(chǎn)科學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為重度子癇前期的患者。

用滅菌PBS洗滌胎盤組織,立即在液氮中快速冷凍,在-80 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。所有?shí)驗(yàn)均經(jīng)樂(lè)山市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有納入產(chǎn)婦均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

HTR8細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;空質(zhì)粒(pcDNA3.1)和SNHG5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-SNHG5)購(gòu)自中國(guó)上海吉瑪公司;siRNA(SNHG5抑制序列)、PCR引物購(gòu)自中國(guó)廣州瑞博公司;TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;PrimeScript RT Master Mix及PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;Opti-MEM培養(yǎng)液及Lipofectamine2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Matrigel膠、Tanswell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司;SDS裂解液及蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;小鼠抗人CXCR4單克隆抗體、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

常規(guī)復(fù)蘇HTR8細(xì)胞,接種于含10%胎牛血清,100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2無(wú)菌培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HTR8細(xì)胞,按照Lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明書步驟,分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(pcDNA3.1)、SNHG5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-SNHG5)、siRNA(SNHG5抑制序列),分為:過(guò)表達(dá)組、抑制組和對(duì)照組(NC組)。每組設(shè)置5孔重復(fù)。轉(zhuǎn)染后6 h,第一次細(xì)胞換液,培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)胎盤組織lncRNA-SNHG5及轉(zhuǎn)染后HTR8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-SNHG5、miR-155、CXCR4 mRNA的表達(dá)

按照TRIzol試劑盒說(shuō)明步驟提取凍存sPE組、正常組胎盤組織及各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總RNA,并檢測(cè)RNA質(zhì)量。根據(jù)PrimerBank公布的基因序列設(shè)計(jì)合成lncRNA-SNHG5、miR-155、CXCR4及內(nèi)參U6、β-actin的引物序列,具體序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因引物序列及PCR反應(yīng)條件

使用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄合成lncRNA-SNHG5、CXCR4cDNA。使用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成MiR-155 cDNA。分別以U6、β-actin為內(nèi)參,按照SYBR Premix ExTaq試劑盒說(shuō)明行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。采用基于比較Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。每次設(shè)定3個(gè)復(fù)孔,各重復(fù)3次。

1.5 Transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HTR8細(xì)胞的侵襲能力

將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種在涂有Matrigel膠的Transwell(8 μm)的頂室上。細(xì)胞于上室中使用不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),下室裝有含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,用70%乙醇固定侵入小室的細(xì)胞,并用0.1%結(jié)晶紫染色,并在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)侵入細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)與抑制miR-155后HTR8細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)

通過(guò)使用SDS裂解溶提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離等量的蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。將膜用5%脫脂乳在室溫下封閉1 h,然后在4 ℃下與小鼠抗人CXCR4(1 ∶2 500)、小鼠抗人GAPDH(1 ∶1 500)單克隆抗體孵育過(guò)夜。將膜與HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)檢測(cè)目的蛋白印跡條帶。目的蛋白的表達(dá)量以CXCR4/內(nèi)參GAPDH比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS19.0軟件。使用Student’st檢驗(yàn)或單因素ANOVA分析不同組間的差異。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-SNHG5在重度PE胎盤中的表達(dá)

sPE組和正常組產(chǎn)婦在年齡[(26.55±3.21)歲vs(25.98±3.77)歲],體質(zhì)量指數(shù)[(27.13±3.51)kg/m2vs(27.98±3.12)kg/m2]、孕周(35.13±4.32vs36.98±2.78)方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組相比,sPE組lncRNA-SNHG5表達(dá)水平降低(0.88±0.22vs0.61±0.20,F=4.626,P<0.01,見(jiàn)圖1)。

與正常組比較,**P<0.01圖1 lncRNA-SNHG5在正常與重度PE胎盤中表達(dá)水平Figure 1 Comparison of lncRNA-SNHG5 expression between normal tissue and severe PE placenta

2.2 轉(zhuǎn)染后lncRNA-SNHG5 mRNA在各組HTR8細(xì)胞中的表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,lncRNA-SNHG5 mRNA在過(guò)表達(dá)組HTR8細(xì)胞中表達(dá)水平顯著增高,在抑制組中表達(dá)水平顯著降低,以上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖2)。

2.3 lncRNA-SNHG5對(duì)miR-155/CXCR4表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與抑制組相比,過(guò)表達(dá)組HTR8細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SNHG5后,miR-155表達(dá)水平降低(F=21.301,P<0.01,見(jiàn)圖3);與抑制組相比,過(guò)表達(dá)組HTR8細(xì)胞中CXCR4 mRNA水平(F=50.18,P<0.01)和蛋白表達(dá)水平(F=79.08,P<0.01)均升高(見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組比較,**P<0.01圖2 lncRNA-SNHG5在HTR8細(xì)胞中的表達(dá)水平Figure 2 Expression of lncRNA-SNHG5 in HTR8 cells of each group

2.4 lncRNA-SNHG5對(duì)HTR8細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力升高,抑制組細(xì)胞侵襲降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=355.69,P<0.01,見(jiàn)圖4)。

3 討論

PE作為妊娠期特有疾病,發(fā)病率較高,嚴(yán)重威脅母嬰健康。其病因尚未完全明確,螺旋動(dòng)脈重鑄不足,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥、遺傳等均與之相關(guān);滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能的下降可導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重塑障礙、胎盤淺著床已被認(rèn)為是PE發(fā)病機(jī)制的重要過(guò)程[9]。目前,已有諸多研究明確了PE妊娠胎盤組織中差異表達(dá)的非編碼RNA(包括miRNAs、lncRNAs),這些非編碼RNA能夠介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞功能發(fā)生變化,可能參與了PE發(fā)病過(guò)程[2,10]。本研究顯示,與正常晚孕胎盤組織相比,lncRNA-SNHG5在重度PE患者胎盤組織中呈病理性低表達(dá)(P<0.05)。lncRNA-SNHG5與直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌等腫瘤密切相關(guān),通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等[11],參與疾病過(guò)程。但目前SNHG5與妊娠相關(guān)疾病的報(bào)道不多,且lncRNA參與疾病的相關(guān)具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

與對(duì)照組比較,**P<0.01;與抑制組比較,##P<0.01圖3 HTR8細(xì)胞中miR-155、CXCR4 mRNA及蛋白的表達(dá)水平Figure 3 Expression of miR-155, CXCR4 mRNA and protein level in HTR8 cells in each group

與對(duì)照組比較,**P<0.01;與抑制組比較,##P<0.01圖4 lncRNA-SNHG5對(duì)HTR8細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of lncRNA-SNHG5 on invasive ability of HTR8 cells in each group

基因組測(cè)序項(xiàng)目表明,人類基因組中有超過(guò)90%的基因組被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA,而lncRNA與miRNA作為最為重要的兩類非編碼RNA,除外能夠通過(guò)影響基因、表觀遺傳學(xué)等參與調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程外,這兩者間還能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、“海綿效應(yīng)”等方式[12,13],相互關(guān)聯(lián),互相影響,共同構(gòu)成了一個(gè)精細(xì)、復(fù)雜、值得探究的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。黑色素瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-SNHG5與miR-155之間的負(fù)向調(diào)控關(guān)系已得到驗(yàn)證[5],SNHG5能夠通過(guò)對(duì)miR-155發(fā)揮ceRNA作用,間接影響相關(guān)細(xì)胞功能。本研究利用細(xì)胞平臺(tái),在人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8中通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),對(duì)lncRNA-SNHG5進(jìn)行過(guò)表達(dá)與抑制后,顯示miR-155表達(dá)出現(xiàn)了負(fù)性調(diào)控(P<0.05),這與Yan等[5]的研究結(jié)果一致。

miR-155可通過(guò)靶向調(diào)控CXCR4表達(dá)影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、遷移[8]。而本研究提示lncRNA-SNHG5與PE相關(guān)。在人滋養(yǎng)細(xì)胞系中,lncRNA-SNHG5可負(fù)向調(diào)控miR-155的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,本課題組進(jìn)一步進(jìn)行了Transwell侵襲試驗(yàn),證明過(guò)表達(dá)SNHG5后HTR8細(xì)胞侵襲能力升高(P<0.05);抑制其表達(dá),則HTR8細(xì)胞侵襲力降低(P<0.05)。雖然研究結(jié)果顯示,lncRNA-SNHG5表達(dá)下降可導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降,這中間介導(dǎo)機(jī)制還不明確。故本課題對(duì)miR-155靶基因CXCR4表達(dá)進(jìn)行深入分析,顯示SNHG5表達(dá)減弱后HTR8細(xì)胞中CXCR4在mRNA及蛋白水平均下降(P<0.05),這與張展等[14]的發(fā)現(xiàn)具有一致性。該結(jié)果提示lncRNA-SNHG5通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-155，進(jìn)一步影響CXCR4表達(dá)，可能是其導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降的相關(guān)機(jī)制。

CXCR4作為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF1)的特異性受體,廣泛存在于母胎界面重要組織細(xì)胞中[15](胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜自然殺傷細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá));CXCR4與miR-155在3′ UTR端具有互補(bǔ)結(jié)合的種子序列[7],有負(fù)性調(diào)控關(guān)系;CXCR4通過(guò)與SDF1的結(jié)合[16],在母胎界面中調(diào)控其下游相關(guān)通路,發(fā)揮交互作用,影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能。PE時(shí)CXCR4/SDF1的失衡,進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力異常、胎盤淺著床的部分機(jī)制已得到驗(yàn)證[17]。根據(jù)本研究結(jié)果顯示:PE相關(guān)lncRNA-SNHG5過(guò)表達(dá)可能對(duì)miR-155發(fā)揮了ceRNA樣作用,內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并吸附miR-155,導(dǎo)致miR-155的表達(dá)被抑制;繼而間接降低了miR-155對(duì)CXCR4的負(fù)性調(diào)控,致使CXCR4表達(dá)增高,解除了miR-155對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的抑制作用,使HTR8細(xì)胞侵襲力提高。反之,當(dāng)lncRNA-SNHG5被抑制時(shí),通過(guò)上述機(jī)制導(dǎo)致HTR8細(xì)胞侵襲力降低。后續(xù)lncRNA-SNHG5與miR-155在滋養(yǎng)細(xì)胞中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的靶點(diǎn),以及在HTR-8細(xì)胞中具體的結(jié)合部位、相關(guān)機(jī)制,還需進(jìn)一步探討。

綜上,研究結(jié)果顯示子癇前期患者胎盤中l(wèi)ncRNA-SNHG5表達(dá)下降,可能通過(guò)影響miR-155/CXCR4途徑導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力下降,可能是PE發(fā)病的潛在機(jī)制,這有待進(jìn)一步探索。而新近研究表明[18],lncRNA已經(jīng)具有了作為PE早期診斷與治療靶點(diǎn)的潛在可能;因此,本研究為后續(xù)探究PE病因機(jī)制,豐富PE的診治手段提供了新的思路和基礎(chǔ)。