內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-miR-105-RyR2信號通路參與房顫發(fā)生的機制研究

胡 蘇,李博濤,王軍奎,趙 娜*

(1西安醫(yī)學(xué)院附屬陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科,西安 710068;2陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科;*通訊作者,E-mail:dr.zhaona@qq.com)

伴隨人口老齡化,心房顫動(atrial fibrillation,AF)患病率逐年增高,據(jù)GBD(global burden of disease)數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計,截止2017年,全球約有3 760萬人口罹患房顫,房顫導(dǎo)致的危害主要包括心力衰竭、缺血性腦卒中及體循環(huán)栓塞,伴隨致殘及致死風(fēng)險增高[1]。關(guān)于房顫的發(fā)生機制目前尚未完全清楚,局灶異位電活動觸發(fā)是目前導(dǎo)致房顫的公認(rèn)學(xué)說之一[2]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是指細(xì)胞在受到氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷、能量代謝障礙等刺激因素時發(fā)生的自我保護機制,ERS激活伴隨葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)表達顯著上調(diào),GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時高度保守的伴侶蛋白,可以用來評估ERS是否活化[3-5]。持續(xù)過度的ERS活化將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡、鈣離子(Ca2+)平衡紊亂,最終影響細(xì)胞功能[6]。鈣離子的瞬間釋放是誘發(fā)心肌細(xì)胞異位電活動觸發(fā)的重要誘因[7]。具體過程如下:心肌細(xì)胞膜L型Ca2+通道激活,少量Ca2+進入心肌細(xì)胞內(nèi),觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上雷尼丁受體2(ryanodine receptor 2,RyR2)表達增加并磷酸化增加,磷酸化RyR2(phosphorylation RyR2,pS-RyR2)開放,釋放大量Ca2+進入胞質(zhì)內(nèi),導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度瞬時增加,形成鈣火花,誘發(fā)異位電活動,成為各種心律失?；A(chǔ)[7-9]。既往文獻[10]提示RyR2磷酸化位點主要包括RyR2絲氨酸(serine,Ser)Ser2808、Ser2809、Ser2814、Ser2815、Ser2830、Ser2845等氨基酸殘基段,其中Ser2808及Ser2814的磷酸化能顯著促進RyR2通道開放而加強鈣火花頻率。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活是否參與房顫的發(fā)生及其具體機制尚未有研究報道。本研究旨在探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與到房顫的發(fā)生，及是否通過影響異位觸發(fā)灶電活動過程參與房顫的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 房顫動物模型制作

將20只8周齡雄性SD大鼠(SPF級,西安交通大學(xué)動物實驗中心,體質(zhì)量185.86 g±6.53 g)隨機分為房顫組和對照組,每組10只。參考文獻[11,12],采用經(jīng)食道高頻電刺激快速心房起搏誘導(dǎo)大鼠房顫發(fā)作。實驗過程中,房顫組大鼠采用戊巴比妥(50 mg/kg,腹腔內(nèi)注射)進行麻醉,密切關(guān)注大鼠情況,避免麻醉過量或不足;取仰臥位固定,四肢皮下描記大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖記錄(BL-420F生物機能系統(tǒng),成都泰盟);頸胸部備皮,沿正中線切開皮膚,鈍性分離肌肉組織,暴露氣管,利用自制氣管插管行氣管插管術(shù)維持大鼠呼吸,必要時使用小動物呼吸機(TKR-200C江西特力)輔助呼吸;經(jīng)大鼠口插入起搏電極(蘇州電子儀器廠,規(guī)格:頭端2個直徑2 mm的環(huán)狀電極,電極間隔2 mm),深度約為7 cm,保持起搏電極前端自然彎曲緊貼左心房,根據(jù)心房心電圖捕獲情況適時調(diào)整電極深度,尾端連接生理、藥理電子刺激儀(YLS-9A,北京眾實)高頻電刺激經(jīng)食道快速心房起搏誘導(dǎo)大鼠房顫發(fā)作。刺激參數(shù)具體如下:①刺激波形為方形波,連續(xù)波輸出;②脈沖寬度6 ms,間隙20 ms;③刺激頻率約1 200次/min;④電壓20 V,電流2 mA;⑤刺激時間:第1天,30 s/次,間隔5 min/次,每天5次/組,第4天行第2輪刺激。⑥大鼠房顫穩(wěn)定發(fā)作7 d以上。對照組除不進行心房起搏外,其余步驟同房顫組。大鼠房顫穩(wěn)定發(fā)作,判讀房顫發(fā)作時心電圖:正常心房P波消失,f波出現(xiàn),中間無等電位線,心室率較前明顯加快。

1.2 大鼠心房肌細(xì)胞分離、乳大鼠心肌細(xì)胞分離及轉(zhuǎn)染

深度麻醉,開胸取出房顫組及對照組大鼠心臟,參考既往文獻[13]分離大鼠心房肌細(xì)胞:①分別分離兩組大鼠心房肌組織棄去其他組織,生理鹽水洗凈后置于4 ℃ D-Hank’s液中反復(fù)沖洗3次。②將心房肌組織用眼科剪剪成1 mm2大小組織塊,胰蛋白酶溶液(0.1% 10 ml)37 ℃水浴8 min,棄去上層混懸液。③膠原酶溶液(0.1% 15 ml)37 ℃水浴并攪拌35 min,吸取上層混懸液,置于預(yù)冷10% DMEM中終止反應(yīng)。④所得沉淀物加入膠原酶溶液(0.1% 15 ml)37 ℃水浴并攪拌35 min,吸取全部液體,終止反應(yīng),所得混懸液用300目濾網(wǎng)濾過除去未消化組織,室溫下800 r/min離心3-5 min,棄去上清液,于沉淀中加入培養(yǎng)液2 ml混勻,所得心房肌細(xì)胞留待備用。⑤取對照組大鼠心房肌細(xì)胞在無血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,應(yīng)用衣霉素(tunicamycin,100 ng/ml)處理孵育48 h建立衣霉素誘導(dǎo)的心房肌細(xì)胞ERS模型[14],設(shè)立衣霉素組。

主要試劑:①D-Hank’s液(NaCl 8.0 g/L,KCl 0.4 g/L,Na2HPO40.7 g/L,H2O 0.06 g/L,KH2PO40.06 g/L,NaHCO30.35 g/L),使用雙蒸去離子水配制,調(diào)整pH=7.2,高壓蒸氣滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆?②培養(yǎng)液(10% DMEM干粉+雙蒸去離子水配置液體)調(diào)整pH=7.2-7.4,正壓過濾除菌后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

乳大鼠心肌細(xì)胞取自出生1-2 d的新生SD大鼠[12]。①從劍突下沿著胸骨剪開乳大鼠胸廓,暴露心臟后,沿心底剪下心臟。②將心肌剪碎呈小片狀,然后應(yīng)用1 mg/ml胰蛋白酶消化5次,5 min/次。③收集除外第1次消化的細(xì)胞懸液,加入含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化,室溫下,1 000 r/min離心10 min,去掉上清,重新混懸于含有100 ml/L(V/V)胎牛血清,添加100 U/ml青霉素,100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,重新種植于6孔板,差速貼壁1 h后,加入100 μmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)。④待心肌細(xì)胞穩(wěn)定后,在無血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,應(yīng)用衣霉素(tunicamycin,100 ng/ml)處理孵育48 h建立衣霉素誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞ERS模型[14],在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-105mimic及mimic NC(negative control)(GenePharma)過表達miR-105作為衣霉素+miR-105 mimic組及衣霉素+mimic NC組,同時乳大鼠心肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-105 mimic及mimic NC設(shè)立對照+miR-105 mimic組及對照+mimic NC組。

1.3 Western blot檢測GRP78、RyR2蛋白及其磷酸化RyR2蛋白表達

應(yīng)用RIPA裂解液,添加苯甲基磺酰氟(PMSF,1 mmol/L)提取組織或細(xì)胞總蛋白。蛋白濃度定量采用BCA蛋白定量法。應(yīng)用100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠分離,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,在50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h,滴加抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)抗體(1 ∶500, Ab21685, Abcam),抗雷尼丁受體2(ryanodine receptor2,RyR2)抗體(1 ∶500,ABIN1874679,北京,中國),抗pS2814-雷尼丁受體2(phospho-serine 2814-ryanodine receptor2,pS2814-RyR2)抗體(1 ∶500,ABIN2707001,北京,中國),抗pS2808-雷尼丁受體2(phospho-serine 2808-ryanodine receptor2,pS2808-RyR2)抗體(1 ∶500,ABIN2707001,北京,中國),滴加抗甘油酸-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(1 ∶1 000, AB-P-R 001,Good Here,杭州,中國)抗體,4 ℃過夜。洗膜后,室溫下,采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG二抗(1 ∶1 000)孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法使條帶顯影,顯影圖像利用吸光度法定量,GAPDH蛋白水平用作內(nèi)參校正蛋白。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)檢測RyR2 mRNA、miR-105

組織或細(xì)胞中的RNA應(yīng)用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),參照試劑盒說明方法提取。PCR產(chǎn)物通過SYBR-green檢測試劑盒由ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)進行半定量檢測。β-actin mRNA、U6分別作為RyR2 mRNA、miR-105內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 生物信息學(xué)預(yù)測

應(yīng)用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測篩選出與RyR2 mRNA 3′非翻譯區(qū)(3′-untranslation region,3′-UTR)存在結(jié)合位點的高度保守的mRNAs。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,根據(jù)情況選Student-t或單因素方差分析并Bonferroni后檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 房顫大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化伴隨雷尼丁受體2活性增加

大鼠ECG檢查提示房顫組大鼠模型成功建立(見圖1)。與對照組比較,房顫組心房心肌組織GRP78蛋白水平表達上調(diào)(P<0.05,見圖2),提示房顫大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化。與對照組比較,房顫組RyR2 mRNA,RyR2蛋白,pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平表達均上調(diào)(均P<0.05,見圖3)。

圖1 房顫大鼠心電圖Figure 1 Electrocardiogram of atrial fibrillationrats

2.2 生物信息學(xué)預(yù)測與RyR2結(jié)合的miRNA及其表達變化

為進一步探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在房顫發(fā)生中參與的機制,應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-105與RyR2 3′UTR區(qū)域存在結(jié)合位點(見圖4)。應(yīng)用real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,房顫組miR-105表達下調(diào)(P<0.05,見圖5)。

與對照組相比,*P<0.05圖2 各組大鼠心房肌組織GRP78表達Figure 2 Expression of GRP78 protein in atrial tissuesin all groups

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖3 房顫大鼠心房肌細(xì)胞RyR2 mRNA、RyR2蛋白及其磷酸化表達Figure 3 Expression of RyR2 mRNA,RyR2 and phosphorylated RyR2 proteins in atrial tissue of atrial fibrillationrats

圖4 生物信息學(xué)方法預(yù)測大鼠miR-105與RyR2 3′UTR存在結(jié)合位點Figure 4 Bioinformatic analysis predicts miR-105is bound with RyR2 3′UTR in rats

與對照組相比,*P<0.05圖5 房顫大鼠心房肌細(xì)胞miR-105表達Figure 5 Expression of miR-105 in atrial myocytes of atrial fibrillationrats

2.3 細(xì)胞水平內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型miR-105表達下調(diào)伴隨RyR2活性增加

使用衣霉素誘導(dǎo)大鼠心房肌細(xì)胞建立細(xì)胞水平內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型,與對照組比較,衣霉素組及房顫組大鼠心房肌細(xì)胞組織GRP78表達均上調(diào)(均P<0.01,見圖6),提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均活化;與房顫組比較,衣霉素組GRP78表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,見圖6)。應(yīng)用real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,衣霉素組及房顫組miR-105表達水平均下調(diào)(均P<0.01,見圖7),RyR2 mRNA表達水平均上調(diào)(均P<0.05,見圖8)。與對照組比較,衣霉素組及房顫組大鼠心房肌細(xì)胞組織RyR2,pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平均表達上調(diào)(均P<0.001,見圖9)。與房顫組比較,衣霉素組miR-105、RyR2 mRNA表達,RyR2、pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,見圖7-9)。

與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001圖6 各組GRP78表達水平Figure 6 Expression of GRP78 in all groups

與對照組相比,**P<0.01圖7 各組miR-105表達水平Figure 7 Expression of miR-105 in all groups

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖8 各組RyR2 mRNA表達水平Figure 8 Expression of RyR2 mRNA in all groups

與對照組相比,***P<0.001圖9 各組RyR2蛋白及其磷酸化表達水平Figure 9 Expression of RyR2 and phosphorylated RyR2 proteins in all groups

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后通過miR-105調(diào)控RyR2表達

與對照+mimic NC組相比,衣霉素+mimic NC組乳大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)衣霉素刺激后GRP78表達水平上調(diào)(P<0.01,見圖10),提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活。于此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-105,與衣霉素+mimic NC組比較,衣霉素+miR-105 mimic組miR-105表達水平上調(diào)(均P<0.01,見圖11);與衣霉素+mimic NC組比較,衣霉素+miR-105 mimic組GRP78蛋白水平表達無變化(P<0.05,見圖10)。與衣霉素+mimic NC組比較,衣霉素+miR-105 mimic組RyR2、pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平表達均下調(diào)(均P<0.05,見圖12)。

與對照+mimic NC組相比,**P<0.01;與衣霉素+mimicNC組相比,#P<0.05圖10 各組GRP78蛋白表達水平Figure 10 Expression of GRP78 protein in all groups

與對照+mimic NC組相比,**P<0.01;與衣霉素+mimic NC組相比,###P<0.01圖11 各組miR-105表達水平Figure 11 Expression of miR-105 in all groups

3 討論

心房顫動所帶來的高致殘率及致死率儼然增添了社會醫(yī)療和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[15],患者的生活質(zhì)量受到影響。關(guān)于房顫觸發(fā)及維持的發(fā)病機制還不明確[1],臨床上治療房顫仍面對諸多困惑。

與對照組+mimic NC組相比,*P<0.05,**P<0.01;與衣霉素+mimic NC組相比,#P<0.05,##P<0.01圖12 各組RyR2 mRNA,RyR2蛋白及其磷酸化表達水平Figure 12 Expression of RyR2 mRNA,RyR2 and phosphorylated RyR2 proteins in all groups

肺靜脈異常電活動觸發(fā)房顫是目前公認(rèn)的重要機制之一[2,16],對于房顫維持機制的假說主要包括多發(fā)子波折返、局灶激動、轉(zhuǎn)子樣激動[17-19]等。心房重構(gòu)、自主神經(jīng)系統(tǒng)作用、遺傳因素、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性增高、心房肌炎性細(xì)胞浸潤以及氧化應(yīng)激[1,20,21]等在房顫的發(fā)生及維持中均發(fā)揮重要調(diào)控作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活是否參與房顫發(fā)生及其具體機制尚未有研究報道。

本研究發(fā)現(xiàn)房顫GRP78表達水平上調(diào),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化,RyR2受體及pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平亦顯著上調(diào)。既往研究[22]提示,離子穩(wěn)態(tài)失衡、藥物及細(xì)胞內(nèi)氧合功能障礙等因素通過作用于cAMP依賴的蛋白激酶A(cAMP-depen-dent protein kinase A,PKA)、鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)使RyR2受體磷酸化增加后,與其緊密結(jié)合的通道穩(wěn)定蛋白Calstabin2(FKBP12.6)相解離,RyR2通道開放增加,鈣觸發(fā)鈣釋放增強,RyR2受體過度磷酸化,Ca2+超負(fù)荷形成內(nèi)向瞬態(tài)電流,導(dǎo)致心肌細(xì)胞延遲后除極(depolarization after delay,DAD),進而引發(fā)心律失常[7]。上述結(jié)果提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化參與房顫發(fā)生。

為了進一步探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與房顫發(fā)生的機制,應(yīng)用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測篩選出高度保守的miR-105與RyR2 mRNA 3′-UTR存在結(jié)合位點。本實驗進一步發(fā)現(xiàn)房顫或應(yīng)用衣霉素激活導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化后miR-105表達下調(diào),同時RyR2mRNA,RyR2、pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平均表達上調(diào),推測miR-105-RyR2通路參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活所致房顫發(fā)生的病理生理過程。

為進一步證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活通過miR-105發(fā)揮調(diào)控作用,利用衣霉素誘導(dǎo)細(xì)胞水平內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后,進一步于乳大鼠心肌細(xì)胞過表達miR-105,發(fā)現(xiàn)RyR2mRNA、RyR2、pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平表達均顯著下調(diào),上述結(jié)果提示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后通過miR-105參與調(diào)控RyR2及其磷酸化水平,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后通過miR-105參與房顫發(fā)生。本研究中所檢測的兩個RyR2磷酸化位點Ser2808、Ser2814其蛋白水平于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后表達上調(diào),結(jié)果提示Ser2808、Ser2814可能是miR-105參與房顫發(fā)生的主要位點,同時提示PKA或CaMKⅡ可能參與房顫發(fā)生的具體研究,但具體機制仍需進一步研究。

本研究顯示長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活,使得磷酸化RyR2水平顯著增加,誘發(fā)肺靜脈心房肌細(xì)胞內(nèi)舒張期鈣離子失平衡,觸發(fā)局灶異位電活動促使房顫發(fā)生,證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與房顫發(fā)生,同時miR-105參與該機制。本研究推測ERS-miR-105-RyR2信號途徑參與房顫的發(fā)生。未來將進一步明確RyR2是否系miR-105的直接調(diào)控靶蛋白,并致力于進一步探究房顫后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化其他相關(guān)上下游信號通路,為揭示房顫發(fā)生的病理生理機制及藥物防治提供新的理論線索。