附子湯對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠抗炎及關(guān)節(jié)影響研究

王波　何友武　趙璐　季衛(wèi)平

[摘要] 目的 探討附子湯對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠抗炎及關(guān)節(jié)的影響。 方法 本研究將32只SD大鼠隨機分成4組：對照組、CIA組、地塞米松組、附子湯組。其中3組通過尾根部皮下注射混合乳劑誘導(dǎo)形成類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型。附子湯組給予7 mL/kg附子湯，地塞米松組給予0.025 mg/kg地塞米松。對照組和CIA組大鼠給予等劑量生理鹽水。監(jiān)測指標：大鼠體重、右后足厚度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)、器官指數(shù)（心、肝、脾、肺、腎和胸腺）、TNF-α、IL-1β和IL-6的血清濃度，同時檢查滑膜組織病理。 結(jié)果 與對照組相比，地塞米松組的大鼠肝、腎指數(shù)顯著上升（P<0.01）及脾、胸腺指數(shù)顯著下降（P<0.01）。CIA組和附子湯組的肺、心指數(shù)與對照組無顯著差異;CIA組、地塞米松組和附子湯組大鼠右后足厚度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)與對照組有顯著性增加（P<0.01），治療后足爪厚度顯著下降（P<0.01）;CIA組大鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平顯著高于正常大鼠（P<0.05）。經(jīng)附子湯及地塞米松治療，CIA大鼠血清中TNF-α， IL-1β和IL-6的水平均顯著下降（P<0.01）;HE染色結(jié)果顯示對照組滑膜、軟骨和骨組織無病變。附子湯和地塞米松治療后滑膜中病理得到明顯改善。 結(jié)論 附子湯可以抑制炎癥因子的釋放來緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，從而保護關(guān)節(jié)，為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供了一種有效的治療藥物。

[關(guān)鍵詞] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;附子湯;中國傳統(tǒng)藥物;炎癥因子

[中圖分類號] R285.5;R593.22 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）21-0040-05

Study on effect of aconite decoction on anti-inflammation and joints of rats with chronic infectious arthritis

WANG Bo HE Youwu ZHAO Lu JI Weiping

Department of orthopedic， Lishui People's Hospital in zhejiang Province（NO. 6 Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， NO.1 Affiliated Hospital of Lishui College）， Lishui 323000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of aconite decoction on anti-inflammation and joints of rats with chronic infectious arthritis. Methods In this study， 32 SD rats were randomly divided into four groups： the control group， the CIA group， the dexamethasone group and the aconite decoction group. Three of the groups were induced to form a model of chronic infectious arthritis（CIA） by subcutaneous injection of mixed emulsion at the tail roots. The aconite decoction group was given 7 mL/kg of aconite decoction and the dexamethasone group was given 0.025 mg/kg of dexamethasone. Rats in the control group and the CIA group were given equal doses of normal saline. The rats were monitored for body weights， right hind foot thicknesses， arthritis indexes， organ indexes（heart， liver， spleen， lung， kidney and thymus） and serum concentrations of TNF-α， IL-1β and IL-6. The synovial tissue pathology was also examined. Results Compared with the control group， liver and kidney indexes of the rats in the dexamethasone group were significantly increased（P<0.01）， and spleen and thymus indexes were significantly decreased（P<0.01）. No significant differences in lung， heart indexes between the CIA group and the control group. The right hind foot thicknesses and arthritis indexes in the CIA group， the deyamethasone group and the aconite deloction groups were significantly increased compared with the control group（P<0.01）， and the hind paw thicknesses were significantly decreased after treatment（P<0.01）. The serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 of the rats in the CIA group were significantly higher than those of the normal rats（P<0.05）. After treatment with aconite decoction and dexamethasone， the serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 were significantly decreased in CIA rats（P<0.001）. No lesions in synovial membrane， cartilage and bone tissue in the control group were observed in the results of HE staining. After treatment with aconite decoction and dexamethasone， the pathology of synovial membrane was obviously improved. Conclusion Aconite decoction can inhibit the release of inflammatory factors to relieve chronic infectious arthritis， thereby protecting the joints and providing an effective therapeutic drug for chronic infectious arthritis.

[Key words] Chronic infectious arthritis; Aconite decoction; Traditional Chinese medicine; Inflammatory factors

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎影響全球0.5%～1.0%的人口，并且在年齡、性別、種族和地理群體之間分布差異很大[1，2]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作為一種系統(tǒng)性自身免疫疾病，其特征為慢性進展性滑膜炎和對稱性多關(guān)節(jié)破壞，主要累及小關(guān)節(jié)，如果不加控制，隨著疾病的進展，大關(guān)節(jié)和鄰近的關(guān)節(jié)組織也會受累[3，4]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的典型病理學(xué)表現(xiàn)為滑膜增生、炎性細胞浸潤、血管翳形成、關(guān)節(jié)軟骨損傷及骨侵蝕。該疾病的臨床表現(xiàn)主要為慢性的疼痛、關(guān)節(jié)僵硬和腫脹，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能障礙和殘疾[5]，因此被列為高風(fēng)險致殘性疾病，給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[6]。附子湯是《傷寒論》中一種經(jīng)典方劑，也是溫陽法的代表方劑之一，首見于張仲景《傷寒論·辨少陰病脈證并治篇》第304條“少陰病，得之一二日，口中和，其背惡寒者，當灸之，附子湯主之”。方中以附子溫腎陽、散寒濕、通經(jīng)脈、走骨節(jié)和經(jīng)絡(luò)、壯陽氣、止疼痛。人參大補元氣，與附子同用，溫陽之中以補氣，振奮陽氣，驅(qū)逐內(nèi)外寒濕，調(diào)營養(yǎng)衛(wèi)，以調(diào)暢肌膚營衛(wèi)。白術(shù)燥寒濕、益中氣，與附子同用，溫補陽氣，驅(qū)散寒濕，茯苓健脾益氣滲濕，使?jié)裥暗靡韵滦?，白芍和營血，通血痹，與附子同用，溫陽以益陰，并制約附子之燥性[7，8]。諸藥合用，溫暖腎陽之中以補陽，驅(qū)散寒濕以走內(nèi)外，以達愈疾之目的[9]。目前有關(guān)附子湯對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效的報道有限。本研究旨在評估附子湯對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（浙）2015-0009），重量為180～220 g。將所有動物飼養(yǎng)在溫控室[（22±2）℃]中，并自由食用標準顆粒飼料和水。在實驗前將所有大鼠適應(yīng)性喂食7 d。所有動物實驗均按照溫州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會規(guī)章制度進行。在適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將32只大鼠隨機分成4組，每組8只：對照組（Control Group），CIA組（CIA Group），地塞米松組（Dex Group），附子湯組（FD Group）。

1.2 實驗試劑

附子、白術(shù)、茯苓、黨參和白芍均購自麗水市人民醫(yī)院中藥房。地塞米松針購自卓峰制藥有限公司（鄭州，中國）。牛Ⅱ（CⅡ）膠原蛋白及不完全弗氏佐劑（IFA）來自Chondrex，Inc（華盛頓，美國）。TNF-α，IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒均購自cusabio biotech co，.LTD.（武漢，中國）。

1.3 附子湯的制備

用100 mL水浸泡附子（36 g），白術(shù)（36 g）、茯苓（27 g）、黨參（18 g）和白芍（27 g）與400 mL水混合浸泡30 min。大火加熱附子，直至沸騰，調(diào)低至小火煎30 min[22，23]。隨后將浸泡的白術(shù)、茯苓、黨參和白芍加入到正在煎煮的附子中，再共同煎煮30 min。倒出藥汁，用雙層吸水紗布過濾。再向煎煮的藥物中加入等量的水，以相同方式加熱30 min進行第二次煎煮。將第一次和第二次煎煮的藥汁混合，加熱濃縮至18 mL，其中生藥量2 g/mL，置于冰箱中4℃保存。

1.4 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型的建立及給藥

把溶于醋酸的牛Ⅱ膠原蛋白（2 mg/mL）與不完全弗氏佐劑按1：1量配比，在冰浴下使用恒溫磁力攪拌器充分混合，制備成混合乳劑，取少量混合乳劑滴在水面不散開認為混合乳劑已制備完成。對除對照組之外的大鼠誘導(dǎo)建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型。第1天于大鼠右后足皮下注射0.1 mL混合乳劑，第7天加強免疫，于相同部位再次注射相同劑量混合乳劑。第14天CIA模型建立完成[9]。對照組在第1天及第7天于相同位置注射等量生理鹽水。第15～28天，附子湯組每天同一時間大鼠灌胃附子湯劑量為7 mL/kg，地塞米松組給藥劑量為0.025 mg/kg，對照組和模型組大鼠喂以等劑量生理鹽水。

1.5 體重和足爪厚度的測定

CIA模型建立成功后，每3天監(jiān)測大鼠的生存狀態(tài)和記錄體重。使用游標卡尺測量右后足厚度（MNT Technology Co.，Ltd.，Germany），評估右后爪的腫脹程度并拍取照片。

1.6 評估關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）

從第3天開始每3天評估一次大鼠關(guān)節(jié)炎嚴重程度。通過五級評分量表評估類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的嚴重程度：4=整個足爪及踝關(guān)節(jié)腫脹;3=整個足爪腫脹;2=腳趾和腳趾關(guān)節(jié)腫脹;1=腳趾關(guān)節(jié)紅斑或腫脹;0=無紅斑或腫脹。記錄每只大鼠右后足的AI評分[10]。

1.7 血清中炎癥因子水平的測定

第28天，從尾靜脈取血，置于促凝管中30 min，隨后以4000 rpm離心10 min使血清分離。將血清儲存在-80℃冰箱中。嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒的說明操作，通過ELISA試劑盒測量血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）的濃度，檢測波長為450 nm。

1.8 組織病理學(xué)檢查

處死大鼠后，取右下肢，剝?nèi)ハリP(guān)節(jié)表層肌肉和皮膚組織，并在10%緩沖福爾馬林（pH=7.0）中固定3 d。在室溫下于10%硝酸中脫鈣3 d后流水沖洗1 d，再包埋在石蠟中切成薄片（4 μm），切片用蘇木精和曙紅（HE）染色。DM-2000光學(xué)顯微鏡和3100KPA顯微成像系統(tǒng)觀察組織病理學(xué)變化。

1.9 器官指數(shù)

處死大鼠后取出器官（包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺），用生理鹽水沖洗后擦干，記錄器官的濕重以計算器官指數(shù)。器官指數(shù)為器官重量與大鼠體重的比值（mg/g）。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0和SPSS24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析One-Way ANOVA;計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 附子湯對大鼠足腫脹和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

在二次免疫后4 d，造模后的大鼠開始出來明顯炎癥表現(xiàn)，紅斑、大鼠后足中部、踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微程度的腫脹。大鼠尾巴部位明顯有水腫表現(xiàn)。各組大鼠右后足厚度均有增加，其中對照組增加最不明顯，模型組右后足厚度一直維持在較高水平。其他兩組右后足厚度在第14天達到峰值，此時，對各組大鼠給予藥物干預(yù)。隨著藥物治療，腫脹逐漸消退，足爪厚度顯著下降，其中地塞米松組下降最明顯（P<0.01），其次為附子湯組（P<0.01）。見表1。模型組關(guān)節(jié)炎指數(shù)一直維持在較高水平，其他兩組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在第14天達到峰值，隨著藥物治療，腫脹逐漸消退，關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著下降，其中地塞米松組下降最明顯（P<0.01），其次為附子湯組（P<0.01）。見表2。

2.2 附子湯對CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6濃度的影響

模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著高于正常大鼠（P<0.01），說明造模很成功。經(jīng)附子湯及地塞米松治療，CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均顯著下降，地塞米松組下降最為明顯（P<0.01），其次為附子湯組（P<0.01）。見表3。

2.3 附子湯對CIA大鼠組織病理學(xué)的影響

病理切片通過光學(xué)顯微鏡在40倍物鏡下進行觀察，模型組大鼠經(jīng)過注射乳劑（牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑等體積混合乳化），引發(fā)大鼠體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。為了評價附子湯對類風(fēng)濕大鼠的作用，進行病理檢查，結(jié)果如封三圖3所示。對照組滑膜，軟骨和骨組織無明顯病變。模型組病理切片顯示滑膜中炎性細胞浸潤，組織水腫和增生伴軟骨破壞?？诜阶訙偷厝姿珊?，大鼠膝關(guān)節(jié)病理得到明顯改善。附子湯組病理切片具有較少的滑膜增生，炎細胞浸潤和關(guān)節(jié)軟骨侵蝕。地塞米松組的病理切片較附子湯組有更少的炎性細胞浸潤、組織水腫、滑膜增生、軟骨破壞（封三圖4）。與其他三組相比，地塞米松組存在軟骨溶解。從病理角度證明附子湯抗炎作用顯著，可以減緩類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病病程，有效的控制炎癥癥狀。

2.4 對大鼠體重變化和器官指數(shù)的影響

每3天對所有大鼠體重進行監(jiān)測，以研究藥物對其體重變化的影響。在整個實驗中，各組大鼠的體重均逐漸增加。對照組大鼠體重增加最明顯。附子湯組大鼠的體重增幅較模型組要大，地塞米松組大鼠體重增幅較模型組明顯減少且實驗后期體重增幅趨于平緩。

計算心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺指數(shù)，以研究藥物對大鼠器官功能的影響。與對照組相比，地塞米松組的大鼠肝、腎指數(shù)顯著上升（P<0.01）及脾、胸腺指數(shù)顯著下降（P<0.01）。模型組，附子湯組的器官指數(shù)與對照組無顯著差異。見表4。

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎折磨著全世界大約1%的人口，其癥狀包括由于骨骼和軟骨的炎癥損傷而導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹和變形[11]，嚴重病例可能導(dǎo)致全身衰竭，包括心血管、肺、心理和骨骼疾病。目前的藥物治療依賴于糖皮質(zhì)激素和非甾體抗炎藥。合成抗風(fēng)濕藥物，如甲氨蝶呤，顯示出很強的副作用，如致畸和肝毒性[12，13]。通過抑制炎癥功能發(fā)揮作用的生物制劑，如抗腫瘤壞死因子-α，可能會因免疫系統(tǒng)減弱而導(dǎo)致高感染風(fēng)險，如結(jié)核病。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)的慢性疼痛、畸形和功能性殘疾[14]。CIA大鼠模型是一種簡單可靠且可重復(fù)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型[15]。由于與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理學(xué)相似，因此通常用于抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物的臨床前評估[16]。因此建立CIA大鼠模型作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理模型，以評估附子湯的抗風(fēng)濕作用。在CIA大鼠建模完成后，對大鼠的足爪腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)進行評估以反映關(guān)節(jié)炎嚴重程度以及藥物的抗關(guān)節(jié)炎活性。地塞米松組大鼠的足爪腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著減少，說明自身免疫是造成類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因之一。同時，附子湯組的足爪腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)也顯著減少，表明附子湯對CIA大鼠的炎癥進展具有顯著的抑制作用。

隨著類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的進展，滑膜細胞顯著增生，各種炎癥細胞如活化的B細胞、T細胞、漿細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、肥大細胞和中性粒細胞浸潤到滑膜中[17]。隨后，肥厚的滑膜層侵入鄰近的軟骨導(dǎo)致骨侵蝕和不可逆的關(guān)節(jié)損傷[18]。細胞和細胞因子的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)直接涉及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的多種免疫過程[19]。其中炎性細胞因子和抗炎細胞因子之間的不平衡是促進類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的起始和進展的主要因素。隨著人們對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎認識的加深，活性巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β和IL-6被認為是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中重要的炎性細胞因子，參與炎癥的形成和關(guān)節(jié)破壞[20]。本研究結(jié)果顯示模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6濃度較對照組顯著升高，表明模型制備成功。附子湯組大鼠的TNF-α、IL-1β和IL-6濃度與CIA模型相比顯著降低，這與預(yù)期結(jié)果相同，證明附子湯可以抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的進展，這與之前的結(jié)論一致。本研究也通過病理學(xué)評估藥物對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)保護作用，結(jié)果進一步證實了附子湯對關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜炎的抑制作用。模型組病理切片顯示明顯的滑膜增生、組織水腫伴嚴重的炎癥細胞浸潤。附子湯組大鼠的病理切片顯示滑膜增生及組織水腫程度減輕，炎癥控制較好，說明附子湯可顯著改善CIA大鼠的病理學(xué)表現(xiàn)。

地塞米松作為糖皮質(zhì)激素類藥物對炎癥性疾病具有顯著的療效而被廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療[21-24]。因此選取地塞米松作為陽性對照藥物。本實驗結(jié)果表明，地塞米松對CIA大鼠的抗炎作用比附子湯更顯著和有效。但地塞米松組大鼠表現(xiàn)出體重增長緩慢、器官指數(shù)和肝腎功能異常等嚴重的副作用。附子湯組大鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)腫脹的明顯緩解和炎性細胞因子顯著的減少，但未觀察到體重和器官異常的跡象。這些結(jié)果表明，附子湯在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療中具有較低毒性和較好療效。

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（收稿日期：2019-09-03）

[基金項目] 浙江省公益技術(shù)研究項目（LGF18H060004，LGD20H060001）;浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2018ZH061）;浙江省麗水市高層次人才培養(yǎng)資助項目（2017RC21）;浙江省麗水市科技計劃項目（2017ZDXK04）;溫州醫(yī)科大學(xué)教學(xué)改革項目（YB JG201840、YBJG2019063）

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