絡(luò)合萃取-反萃法制備異甘草素的工藝研究

石盤棋, 劉曉霞, 魏舒暢, 孫曉燕, 王繼龍, 馮曉莉, 萬玲娟, 李真真

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心, 甘肅 蘭州 730000)

1 前 言

異甘草素(isoliquiritigenin)是甘草中含有的羥基查耳酮類化合物[1]，屬于黃酮苷元。作為甘草的有效成分，它具有抗腫瘤[2]、解痙、抗氧化、保護肝臟[3]、抗艾滋病[4]、抗糖尿病并發(fā)癥[5]、抗?jié)僛6]、抗炎[7]、抗菌、預(yù)防動脈粥樣硬化[8]等藥理作用。

前人對異甘草素的提取做了研究，水提取法會將淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)一同提取出來，影響提取效果[9]；有機溶劑提取法有機溶劑用量大，收率不高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)[10]；超聲提取法噪聲大、需耗能[11]；微波提取法的耗能、傳熱和傳質(zhì)不均勻是其明顯的缺陷[12]。酶提取法試劑費用昂貴，成本高[13]。目前常用的異甘草素物理液液萃取法具有有機溶劑用量大、溶劑回收成本高、溶劑夾帶損失大、產(chǎn)品中溶劑易殘留等缺點[14]；二氧化碳超臨界萃取存在設(shè)備昂貴、對溫度和壓力要求高等缺點[15]；制備色譜由于所得目標(biāo)物質(zhì)量少，色譜柱填料用量大，使得制備效率低、生產(chǎn)成本高等缺點[16]。

甘草總黃酮包括黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查耳酮類、二氫黃酮類、二氫查耳酮類等[17]。本文在對甘草提取液進行超濾除去大量雜質(zhì)的基礎(chǔ)上，對其中的異甘草素采用絡(luò)合萃取反萃取制備方法[18-19]進行研究。稀釋劑和絡(luò)合劑是絡(luò)合萃取劑重要的組成部分[20]，磺化煤油稀釋劑能改善萃取體系黏度、增大異甘草素溶解度；磷酸三丁酯（tributyl phosphate, TBP）和三烷基氧化膦（trialkylphosphine oxide, TRPO）絡(luò)合劑具有官能團G3P=O，而異甘草素結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，過氧原子上的孤對電子與異甘草素酚羥基上的氫質(zhì)子反應(yīng)形成萃取物，從而將甘草超濾液中的異甘草素萃取出來。通過絡(luò)合萃取劑和反萃取劑優(yōu)選、甘草超濾液中異甘草素絡(luò)合萃取和反萃取條件，以期開發(fā)一種制備異甘草素的新技術(shù)，使以異甘草素為原料的新藥創(chuàng)制成為可能，也為甘草總黃酮的質(zhì)量控制提供了便利條件。

2 儀器與試藥

Agilent-1260型液相色譜儀(美國Agilgent公司)，色譜柱為Hypersil BDS-C18鍵合硅膠柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；AKRY-UP-1816 型超純水機(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)；SJM 陶瓷超濾膜(合肥世杰膜工程有限公司)；MX-RL-Pro LCD 數(shù)控旋轉(zhuǎn)混勻儀(大龍興創(chuàng)實驗儀器北京有限公司)；DD-5M 型湘儀離心機(湘儀離心機儀器有限責(zé)任公司)；DZF-6090 真空干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

三烷基氧化膦(溧陽市凱信化工有限公司)，磷酸三丁酯(分析純，煙臺市雙雙化工有限公司)，磺化煤油(廣東正茂石化有限公司)，石油醚(分析純，沸程60～90 ℃，天津市進豐化工有限公司)，乙腈(色譜純，天津市大帽化學(xué)試劑廠)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

甘草飲片購于蘭州市黃河藥材市場，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏舒暢教授鑒定為Glycyrrhiza uralensis Fish.；異甘草素對照品(批號961-29-5，含量以98% 計)，北京北納創(chuàng)連生物研究院。

3 方法與結(jié)果

3.1 甘草的提取、超濾工藝

稱取一定量甘草藥材，用24 倍量0.75% 的氨水回流提取3 次，每次用8 倍量提取1 h，合并提取液。靜置取上清液，下層濁液經(jīng)3 000 r·min-1離心機離心15 min，收集上清液，合并2 次上清液，用無機陶瓷膜在孔徑10 nm、壓力0.12 MPa 、溫度25 ℃下超濾，得甘草超濾液，濃縮至0.2 g·mL-1，備用[21]。

3.2 異甘草素的含量測定

3.2.1 對照品溶液的制備

取異甘草素對照品適量，精密稱重，加70% 乙醇制成含異甘草素4.04 μg·mL-1的對照品溶液，備用。

3.2.2 供試品溶液的制備

量取0.2 g·mL-1甘草超濾液、絡(luò)合萃取后的萃余液、反萃取液各1 mL 于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3 色譜條件

參照《中國藥典》2015 年版一部[22]甘草項下及其他相關(guān)文獻[23]報道的高效液相色譜測定條件，采用Hypersil BDS-C18 鍵合硅膠柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.05% 磷酸水溶液(體積比50:50)為流動相，檢測波長為370 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，流量1.0 mL·min-1。色譜圖見圖1。

圖1 異甘草素各溶液HPLC 圖譜 Fig.1 HPLC spectra of isoliquritigenin solution

3.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL對照品溶液，注入高效液相色譜儀測定，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，進樣量為橫坐標(biāo)X (μg)作回歸曲線，得異甘草素回歸方程：Y=2 108.7 X +4.900 5，R2=0.999 9，線性范圍0.004 0～0.080 8 μg。

3.2.5 精密度試驗

精密量取異甘草素對照品溶液適量，按3.2.3 節(jié)所述色譜條件連續(xù)進樣6次。結(jié)果異甘草素峰面積的RSD 為1.7%，說明儀器的精密度良好。

3.2.6 穩(wěn)定性試驗

取3.2.2 節(jié)制備的反萃取液，于 0、1、2、4、8、12、24 h 進樣測定。結(jié)果異甘草素峰面積的RSD 為1.4%，說明供試樣品溶液在制備后的 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.7 重復(fù)性試驗

按3.2.2 節(jié)方法平行制備6 份反萃取液，按3.2.3 節(jié)所述色譜條件進樣測定，結(jié)果異甘草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD 為2.1%，說明該方法的重復(fù)性良好。

3.2.8 加樣回收率試驗 取已測定的同一批反萃取液6 份，每份精密量取10 mL，分別加入異甘草素對照品溶液3.5 mL，按3.2.3 節(jié)色譜條件測定，記錄峰面積并計算回收率，結(jié)果異甘草素的平均加樣回收率為105.82%，其RSD為1.9%，說明該方法的準(zhǔn)確度較好。

3.2.9 異甘草素含量測定

將3.2.2 節(jié)制備的各樣品液按3.2.3 節(jié)條件進行測定，并按回歸方程計算含量。

3.3 萃取方法

量取10 mL 0.2 g·mL-1的甘草超濾液于50 mL 離心管中，再加入等體積的絡(luò)合萃取劑，加蓋將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上萃取10 h (25 r·min-1)，取出，離心10 min (4 000 r·min-1)，取1 mL 下層萃余液于50 mL 容量瓶中，用70% 乙醇定容至刻度，待測。

3.4 反萃取方法

取5 mL 含異甘草素的絡(luò)合萃取液與等體積反萃取劑加入50 mL 離心管中，加蓋并置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上于室溫下萃取10 h (25 r·min-1)，取出，離心10 min (4 000 r·min-1)，取1 mL 下層反萃取液于50 mL 容量瓶中，用70% 乙醇定容至刻度，待測。

3.5 絡(luò)合萃取及反萃取反應(yīng)式

反應(yīng)式中HA 代表異甘草素，上劃線表示組分處于有機相中。

3.6 萃取率及反萃取率的計算

3.7 絡(luò)合萃取劑組成研究

3.7.1 不同絡(luò)合劑對異甘草素萃取效果的影響

以磺化煤油為稀釋劑，TRPO、TBP 為絡(luò)合劑，考察絡(luò)合劑種類和濃度對甘草超濾液中異甘草素萃取效果的影響，結(jié)果見表1。

表1 不同絡(luò)合劑和磺化煤油組合對異甘草素萃取效果的影響 Table 1 The isoliquiritigenin extraction using different complexing agents and sulfonated kerosene combinations

由表1 可知，不同絡(luò)合劑和磺化煤油組合對異甘草素萃取效果為：TRPO＞TBP，說明1%TRPO +99%磺化煤油組合對異甘草素萃取率高，先選擇TRPO 作為絡(luò)合劑。

3.7.2 不同稀釋劑對異甘草素萃取效果的影響

選擇TRPO 作為絡(luò)合劑，磺化煤油和石油醚分別作為稀釋劑，對甘草超濾液中的異甘草素進行萃取，考察稀釋劑種類和濃度對異甘草素萃取效果的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同稀釋劑和TRPO 組合對異甘草素萃取效果的影響 Table 2 The isoliquiritigenin extraction using different diluents and TRPO combinations

由表2 結(jié)果可知，以0.7% TRPO 作為絡(luò)合劑時，不同種類的稀釋劑對甘草超濾液中異甘草素的萃取效果為：磺化煤油 ＞ 石油醚，說明1% TRPO + 99% 磺化煤油組合對異甘草素萃取率高，故選擇磺化煤油作為稀釋劑。

3.7.3 不同體積分?jǐn)?shù)TBP 對異甘草素萃取效果的影響

以磺化煤油為稀釋劑，以不同體積分?jǐn)?shù)TBP 為絡(luò)合劑，對甘草超濾液中的異甘草素進行萃取，考察不同體積分?jǐn)?shù)TBP 對異甘草素萃取效果的影響。結(jié)果見表3。

表3 不同體積分?jǐn)?shù)TBP 和磺化煤油組合對異甘草素萃取效果的影響 Table 3 The isoliquiritigenin extraction using different volume fraction TBP and sulfonated kerosene combinations

由表3 可知，隨著絡(luò)合劑TBP 體積分?jǐn)?shù)的增加，異甘草素的萃取率也隨之增加，當(dāng)TBP 體積分?jǐn)?shù)增加到15% 時，異甘草素的萃取率達(dá)到最高，初步確定15% TBP+85% 磺化煤油作為絡(luò)合萃取劑。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)TRPO 對異甘草素萃取效果的影響 Fig.2 Effect of complex agent volume fraction on the isoliquiritigenin extraction

3.7.4 不同體積分?jǐn)?shù)TRPO對異甘草素萃取效果的影響

以磺化煤油為稀釋劑，以不同體積分?jǐn)?shù)TRPO 為絡(luò)合劑，對甘草超濾液中的異甘草素進行萃取，考察不同體積分?jǐn)?shù)絡(luò)合劑對異甘草素萃取效果的影響。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著絡(luò)合劑TRPO體積分?jǐn)?shù)的增加，異甘草素的萃取率也隨之增加，當(dāng)TRPO 體積分?jǐn)?shù)增加到1% 時，異甘草素的萃取率達(dá)到最高，初步確定1% TRPO + 99%磺化煤油作為絡(luò)合萃取劑。

3.7.5 三元絡(luò)合萃取劑對異甘草素萃取率的影響

由于二元絡(luò)合劑的TRPO 價格昂貴，不利于異甘草素的工業(yè)制備，出于節(jié)省溶劑方面考慮，以異甘草素的萃取率為指標(biāo)，通過析因?qū)嶒灴疾霻RPO、TBP 在絡(luò)合萃取異甘草素時是否具有協(xié)同作用，以期構(gòu)建出更有優(yōu)勢的TRPO+TBP+磺化煤油三元絡(luò)合萃取體系。

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，將TBP 和TRPO 的濃度確定為析因?qū)嶒灥? 個因素，每個因素取3 個水平，各因素水平平行測定3 次。因素水平表見表4，實驗方案和結(jié)果見表5，采用SPSS-21 軟件對表5 中的數(shù)據(jù)進行2 因素析因設(shè)計的方差分析，結(jié)果見表6。

表4 析因?qū)嶒炓蛩厮奖鞹able 4 Levels of factorial experimental factors

表5 析因?qū)嶒灧桨负徒Y(jié)果 Table 5 Factorial experimental scheme and results

表6 實驗結(jié)果的方差分析表Table 6 Variance analysis of experimental results

由以上實驗結(jié)果可知，當(dāng)異甘草素萃取率達(dá)到99.23% 時萃取劑的組成為0.5% TRPO + 10% TBP + 89.5% 磺化煤油。TBP 的加入可有效減少TRPO 用量，大幅降低萃取劑成本，最終決定選擇三元絡(luò)合萃取體系。

3.7.6 絡(luò)合萃取后異甘草素收率

精密量取甘草超濾液和三元體系萃余液各40 mL，60 ℃ 水浴濃縮后，在60 ℃ 真空干燥箱中揮成干膏，精密稱定兩干膏適量，高效液相測定，由此可得40 mL 超濾液干膏中異甘草素量為0.085 9 mg，40 mL 萃余液干膏中異甘草素量為0 mg，絡(luò)合萃取后異甘草素收率100%。

3.8 反萃取工藝研究

3.8.1 反萃取劑種類對異甘草素萃取效果的影響

為解決萃取劑循環(huán)利用和異甘草素產(chǎn)品中有機溶劑殘留問題，本文對含有異甘草素的絡(luò)合萃取劑(萃合物)進行反萃取，用不同種類反萃取劑對3.7 節(jié)所得萃合物進行反萃取，反萃取結(jié)果見表7。

表7 反萃取劑種類對異甘草素反萃取率的影響 Table 7 Effect of stripping agent type on the extraction rate of isoliquiritigenin

由表7 結(jié)果可知，應(yīng)選擇0.012 5 mol·L-1NaOH 水溶液作為異甘草素的反萃劑。

3.8.2 反萃取劑濃度對異甘草素萃取效果的影響

為提高產(chǎn)品純度、進一步減小反萃取劑用量，本文對反萃取劑濃度進行了進一步考察，結(jié)果見表8。

表8 反萃取劑濃度對異甘草素反萃取率的影響 Table 8 Effect of stripping agent concentration on the back extraction rate of isoliquiritigenin

由表8 可知，在NaOH 的濃度為0.010 0 mol·L-1時，異甘草素的反萃取率仍能夠達(dá)到97.85%。最終選擇0.010 0 mol·L-1NaOH 水溶液作為異甘草素的反萃取劑。

3.8.3 反萃取后異甘草素收率

精密量取三元體系反萃取液40 mL，60 ℃水浴濃縮后，在60 ℃ 真空干燥箱中揮成干膏，精密稱定干膏適量，高效液相測定，由此可得反萃后的干膏中異甘草素量為0.081 7 mg，反萃取后異甘草素收率為95.11%。

3.8.4 異甘草素總收率

40 mL 超濾液干膏中異甘草素量為0.085 9 mg，反萃后的干膏中異甘草素量為0.081 7 mg，總收率95.11%。

3.9 萃取劑的循環(huán)利用對異甘草素萃取效果的影響

為考察萃取劑循環(huán)利用對異甘草素萃取效果的影響，按照上述最佳絡(luò)合萃取和反萃取條件進行3 次萃取劑循環(huán)利用的平行試驗，測得萃取率均值為98.94%，RSD 為0.6%；反萃取率均值95.49%，RSD 為0.9%；結(jié)果顯示，本文運用的絡(luò)合萃取劑能夠被循環(huán)利用。

4 結(jié) 論

本文選用氨水提取異甘草素，氨水的體積分?jǐn)?shù)僅為0.75%，并采用超濾技術(shù)對氨水提取液進行濃縮，除去了提取液中懸浮物和可溶性大分子物質(zhì)，這很好地克服了上述有機溶劑提取異甘草素所具有的缺點。絡(luò)合萃取是通過被萃取物質(zhì)和萃取劑兩者之間的官能基團發(fā)生專屬化學(xué)反應(yīng)，生成可溶于萃取劑的新物質(zhì)(萃合物)來實現(xiàn)分離目的的化學(xué)萃取技術(shù)。該技術(shù)具有從中藥稀提取液中萃取含量很低的待分離物質(zhì)的特點，在甘草超濾液不經(jīng)濃縮的情況下，高效萃取富集了異甘草素，縮短了工藝流程。此外，萃取劑經(jīng)反萃取可實現(xiàn)循環(huán)使用，可實現(xiàn)低成本、環(huán)保、產(chǎn)品無有機溶劑殘留。