基于紅外光譜指紋圖譜的肉桂提取物質量控制

李 寧 李 瀅 劉 暘 郭明里 任 超 黃 茜 楊兆祥 張建文*

（1.昆藥集團股份有限公司， 云南昆明650100； 2.大理大學， 云南大理671000）

中藥肉桂是樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥樹皮。肉桂始載于《神農本草經》，列為上品。中醫(yī)傳統(tǒng)認為肉桂具有補火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經脈的功效，臨床用于陽痿宮冷、腰膝冷痛、腎虛作喘、虛陽上浮、眩暈目赤、心腹冷痛、虛寒吐瀉、寒疝腹痛、痛經經閉等證的治療［1?2］?，F代研究表明肉桂中主要含有揮發(fā)油、二萜及其糖苷、黃烷醇及其多聚體，此外還含有黃酮及其苷類、木脂素及其苷類、簡單芳香類、多糖類等多種類型的化合物，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗補體、抗腫瘤、抗菌等藥理作用［3］。

肉桂用于預防和治療病毒感染的研究報道極少。近期美國福克斯健康新聞報道在家養(yǎng)肉桂植物中發(fā)現抗病毒活性成分［4］，但未見具體的研究結果。經文獻搜索發(fā)現以色列特拉維夫大學已在中國知識產權局獲得了一個與肉桂提取物抗病毒相關的專利［5］，經仔細分析該專利只對肉桂抗病毒成分的制備和抗病毒結果做了簡短描述，沒有活性成分的物質基礎以及質量控制方法的詳細分析。最近有研究報道肉桂的水提物或從肉桂中制備的花青素與多酚類形成的多聚體可以有效的阻斷H7N3和HIV 進入細胞從而表現出顯著的抗病毒作用［6?8］。根據上述信息，課題組制備了肉桂水溶性抗病毒有效部位KPC?rg1，該部位為大分子水溶性多酚，且具有糖類結構片段［9］。使用激光束投射實驗證明KPC?rg1 溶液呈現典型的丁達爾效應，暗示KPC?rg1 在溶液中以溶膠態(tài)存在。課題組對KPC?rg1 抗病毒活性進行系統(tǒng)分析［9］，再次證明該有效部位對多種病毒有顯著的抑制活性，而且認為KPC?rg1 擁有的抗病毒活性與KPC?rg1的膠體性質有關。當KPC?rg1 膠體碰上病毒顆粒后會立即與之結合形成非常穩(wěn)定的超納米結構，從而阻止病毒侵入細胞，即所謂“原位固化滅活效應”?；贙PC?rg1 擁有的這一特殊的病毒滅活機制，課題組認為KPC?rg1 不但可用于各類皰疹病毒如帶狀皰疹病毒和單純皰疹病毒感染外用治療性藥物的開發(fā)，還可以用于感染性極強的包膜類病毒如H1N1和HIV 病毒滅活疫苗制備的探索。

肉桂水溶性抗病毒有效部位的化學成分復雜，研究認為其分子量大于或等于10 kDa［5］。由于分子量大，極性強，溶解度低，缺乏有效的分離手段，至今尚未從中分離得到單體化合物并鑒定結構。目前，肉桂及其制劑的質量評價多以揮發(fā)油及其他小分子次生代謝產物（如桂皮醛、肉桂酸） 為化學指標，建立相應的含有量測定及指紋圖譜分析方法［2］。這些方法難以滿足如KPC?rg1 的水溶性有效部位的質量控制要求。由于質量控制方法缺失，難以保證KPC?rg1 質量的穩(wěn)定性及均一性，進而難以保證其安全性及有效性。

近年來，紅外光譜指紋圖譜在中藥指控領域取得了較大進展［10?14］。該方法具有自身鮮明的技術特點： 樣品前處理簡單，基本不使用有毒、有害試劑，分析速度快，操作簡單，分析成本低。紅外光譜指紋圖譜基于分子中官能團振動、轉動的能級躍遷，直接反映化學結構，無需化學對照品，能夠同時對樣品多種成分進行分析表征，反映樣品宏觀（整體） 化學信息，體現中藥作用的整體性和模糊性。

本研究采用中紅外光譜技術結合化學計量學分析KPC?rg1 的指紋圖譜，以期探索符合KPC?rg1 特點的質量控制方法。在此基礎上，對不同原料、不同制備工藝及不同儲存時間的KPC?rg1 進行比較分析，以期為KPC?rg1 的進一步研究和開發(fā)提供參考。

1 材料

肉桂藥材于2015 年5 月購自云南昆明螺螄灣中藥材市場，產地云南。錫蘭肉桂Cinnamomum zeylanicumBl.于2015 年10 月購于美國，產地斯里蘭卡。陰香Cinnamomum burmanni（Nees et T.Nees） Blume 藥材于2015 年10 月購自廣西玉林中藥材市場，產地廣西。所有藥材經昆藥集團股份有限公司李寧博士鑒定為正品，憑證標本存放于昆藥集團股份有限公司藥物研究院天然產物部。BrukerTensor 27紅外光譜儀（德國Bruker 公司）。紅外光譜測定壓片用KBr為光譜純。KPC?rg1 制備用水為去離子水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 KPC?rg1 制備 參照文獻 ［9］，將藥材粉碎，過60 目篩，10 倍量水20 ℃浸泡提取3 次，每次2 h。提取液過濾，取濾液，濃縮，加入0.3 mol／L 酸性磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），以鹽酸調pH 至3.0，靜置。取沉淀部分，即得。并在此基礎上對工藝參數加以調整，樣品信息見表1。

2.2 紅外光譜測定 紅外光譜分析過程中室內溫度保持20～25 ℃，空氣相對濕度保持30%～40%。將待測樣品置于干燥器中24 h 以上，精密稱取各待測樣品2.0 mg，分別與100 mg 干燥的KBr 混合，于瑪瑙研缽中在紅外燈下充分研磨，壓制成透明薄片，放入紅外光譜儀測定。光譜掃描范圍4 000～400 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，掃描累加次數16 次，重復測定3 次，掃描時扣除H2O 和CO2的干擾。

2.3 光譜處理方法與評價 將紅外光譜儀采集的數據（平均圖譜） 導入OriginPro 8 軟件，經過二階導數變換，分別繪制紅外指紋圖譜原始圖譜和二階導數圖譜。將OriginPro 8 軟件處理過的數據導入Excel 2013 軟件，以平均數法分別生成紅外指紋圖譜原始圖譜共有模式和二階導數圖譜共有模式，以相關系數法計算各圖譜與相應的共有模式圖譜的相似度。將Excel 2013 軟件處理過的二階導數數據導入Simca 13 軟件，進行主成分分析。

表1 樣品信息

3 結果與討論

3.1 實驗條件考察

3.1.1 樣品與KBr 混合比例 分別稱取樣品1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg 與100 mg KBr 研磨均勻后壓片，將制得的供試片置于紅外光譜儀中進行測試，結果表明，樣品用量為2.0 mg 時，壓片效果較好，且紅外吸收峰強度較好。

3.1.2 掃描次數 將供試片置于紅外光譜儀中，依次調整掃描次數為2、4、8、16、32 進行測試。結果表明，隨著掃描次數的增加，譜圖的重復性越好，但是測試時間增加。綜合各種因素，選擇掃描次數為16。

3.1.3 重復測定次數 將供試片置于紅外光譜儀中，樣品連續(xù)掃描2、3、5、8 次得到紅外圖譜。結果表明，測量次數越多，測得譜圖的重復性越好，但樣品測試時間越長，綜合各種因素，選擇樣品重復測定次數為3 次。

3.2 方法學考察

3.2.1 精密度試驗 取同一批KPC?rg1 樣品，按“2.2”項下方法制備供試片，并連續(xù)測定6 次，對比紅外指紋圖譜。結果所得譜圖的譜線重合，表明儀器精密度良好。

3.2.2 重復性試驗 取同一批KPC?rg1 樣品，按“2.2”項下方法平行制備6 份供試片，分別置于紅外光譜儀中測定。結果所得譜圖的譜線重合，表明該方法重復性良好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批KPC?rg1 樣品，按“2.2”項下方法制備供試片，置干燥器中保存，分別于0、1、2、3、4、5、8、12、24 h 測定所得紅外譜圖。結果顯示24 h內所得紅外圖譜的譜線重合，表明樣品壓片后24 h 內穩(wěn)定性良好。

3.3 樣品檢測 按“2.2” 項下實驗方法分別對20 批樣品進行紅外測試，按“2.3” 項下數據分析方法對原始數據進行處理。20 批樣品紅外原始指紋圖譜見圖1。KPC?rg1 樣品紅外原始指紋圖譜于3 432、1 618、1 523、1 445、1 284、1 105 cm-1等區(qū)段有較為明顯的特征吸收峰，不同植物來源及不同制備方法得到的提取物指紋圖譜大體一致。

圖1 20 批樣品紅外原始指紋圖譜

S1～S10 為采用標準制備方法制備的KPC?rg1 樣品，選取S1～S10 以平均數法生成共有模式見圖2，20 批樣品以相關系數法計算與共有模式的相似度，計算結果見表2。4 000～400 cm-1范圍內紅外指紋圖譜的相似度均大于0.950，16 批樣品高于0.990，表明其總體化學成分具有一定的相似性。S8、S9、S10 以及S14 的相似度低于0.990，表明其化學成分同共有模式有差異?？傮w而言，紅外原始指紋圖譜能夠對KPC?rg1 的化學成分進行快速表征，但指紋圖譜的區(qū)分度不理想。

圖2 樣品紅外原始指紋圖譜共有模式圖

表2 20 批樣品紅外原始指紋圖譜相似度

為進一步挖掘紅外指紋圖譜包含的化學信息，課題組對紅外原始圖譜進行了二階導數變換分析。20 批樣品的紅外二階導數指紋圖譜與共有模式見圖3～4，相似度見表3。二階導數指紋圖譜可在一定程度上減少圖譜重疊峰的疊加，提高圖譜的分辨率，體現更多的結構信息。其中S1～S7 相似度均在0.950 以上，提示其化學一致性較好。S8～S10 的相似度低于0.950，特別是S9，相似度僅為0.768。該3 個樣品的制備時間距測試時間較長，經歷了約6 個月的儲存期。KPC?rg1 含有多酚類物質，在放置過程中容易發(fā)生結構變化。這一結果表明需進一步深入研究其穩(wěn)定性并優(yōu)化儲藏條件。S11～S12 為工藝摸索過程中改變提取溫度的樣品，其相似度高于0.950，提示KPC?rg1 的化學成分對考察的提取溫度變化不敏感。S13、S14、S16、S17 為工藝摸索過程中改變鹽析pH 樣品，其相似度遠低于正常工藝樣品，表明pH 在KPC?rg1 制備過程中非常重要。S15 改變了鹽析工藝的鹽溶液濃度，其相似度大于0.950，提示KPC?rg1 的化學成分對考察的鹽溶液濃度變化不敏感。S18～S20 為采用錫蘭肉桂及陰香制備的KPC?rg1 樣品，其相似度低于0.350，提示其物質基礎同肉桂制備的KPC?rg1 樣品有較大的差異。二階導數指紋圖譜具有較好的區(qū)分度，不但能夠對不同植物來源的樣品進行區(qū)分判別，同時能夠反映制備工藝對產品化學成分的影響。

基于20 批樣品的紅外二階導數指紋圖譜建立主成分分析模型。第一主成分（PC1） 和第二主成分（PC2） 的得分散點圖見圖5。所有樣品大致聚為兩類，S1～S12 以及S15 聚為一類，S13、S14 及S16～S20 聚為另一類。S1～S12以及S15 均為采用肉桂藥材制備的KPC?rg1。同相似度評價結果相似，改變提取溫度的樣品S11～S12 以及改變鹽析工藝鹽溶液濃度的樣品S15 與采用標準制備工藝的樣品S1～S10 聚為一類，提示其化學成分的一致性較好。采用錫蘭肉桂及陰香制備的樣品S18～S20 與以上樣品在得分圖上的分布有明顯的距離。改變鹽析pH 的樣品S13、S14、S16 及S17 與標準制備工藝的樣品S1～S10 也有明顯的區(qū)分。

圖3 20 批樣品紅外二階導數指紋圖譜

圖4 樣品紅外二階導數指紋圖譜共有模式圖

表3 20 批樣品紅外二階導數指紋圖譜相似度

剔除S13、S14 及S16～S20 后，對S1～S12 以及S15 共13 批樣品再次進行主成分分析。得分散點圖見圖6。改變提取溫度的樣品S11～S12 以及改變鹽析工藝鹽溶液濃度的樣品S15 基本落入S1～S7 的范圍。儲存時間較長的樣品S8～S10 分布較為離散。

以上結果表明該主成分分析模型能夠反應不同樣品的化學結構差異，有良好的鑒別能力。紅外二階導數指紋圖譜主成分分析與相似度分析的結果趨向一致，分組結果相同。分析方法不同，其分析的依據與參數均有差異，從不同的角度出發(fā)，采用不同的分析方法，得到相同或相近的分析結果，表明2 種方法在分析此類問題上，較為可靠，可用于肉桂提取物的質量評價。

圖5 20 批樣品紅外二階導數指紋圖譜主成分分析得分散點圖

圖6 13 批樣品紅外二階導數指紋圖譜主成分分析得分散點圖

4 結論

本研究首次采用中紅外光譜技術結合化學計量學分析研究KPC?rg1 的指紋圖譜，以期探索符合KPC?rg1 特點的質量控制方法。在此基礎上，對不同原料，不同制備工藝及不同儲存時間的KPC?rg1 進行比較分析。本實驗建立的肉桂提取物紅外指紋圖譜檢測方法操作簡單，快速，具有良好的精密度、重復性、穩(wěn)定性，能夠反映樣品宏觀（整體） 化學信息。結合化學計量學分析，不但能夠對不同植物來源的樣品進行區(qū)分判別，同時能夠反映制備工藝對產品化學成分的影響。該方法尤其適用于結構復雜、物質基礎尚不清晰的復雜體系的質量控制，能夠用于肉桂提取物的質量評價并指導進一步的制備工藝參數優(yōu)化，以期為KPC?rg1 的進一步研究和開發(fā)提供參考。