UPLC?Q?TOF?MS／MS 分析不同黑豆汁蒸制法對何首烏成分的影響

趙 琴 黃惠紅 汪穎舒 朱廣灝 李杰榮 駱前飛 尹一鳴 劉伊晨修彥鳳*

（1.上海市奉賢區(qū)中醫(yī)醫(yī)院， 上海201499； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 上海201203）

中藥何首烏具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝、益智等多方面的藥理作用［1］，其肝毒性問題也有越來越多的報(bào)道［1?4］。多篇文獻(xiàn)報(bào)道生何首烏與制何首烏對大鼠肝臟都有不同程度的影響，但制何首烏毒性降低［5?7］，長期大劑量灌胃制何首烏才會引起肝損傷，常用劑量對大鼠無毒副作用［8］，不同工藝炮制的何首烏對肝細(xì)胞的毒性有所不同［9］，炮制是降低何首烏毒性的有效手段，炮制工藝的差異與其療效和毒性密切相關(guān)。制何首烏炮制方法的研究是解決何首烏毒性的重要方向。

經(jīng)過查閱文獻(xiàn)和調(diào)研，發(fā)現(xiàn)拌入黑豆汁后蒸制是目前《中國藥典》 和各省市的中藥炮制規(guī)范均收載的方法，但操作方法有所不同，有與黑豆汁拌后蒸至內(nèi)外均呈棕褐色［10］，無炮制時間的規(guī)定；或白天蒸8 h 后晚上悶，第2 天翻動后繼續(xù)蒸［11］，也有僅蒸制1 d 即停止炮制；或?yàn)榱颂岣咝什捎酶邏赫? h［12］。在實(shí)際生產(chǎn)中，制何首烏的炮制工藝存在著拌入黑豆汁后常壓連續(xù)蒸制、反復(fù)蒸與悶和高壓蒸制的不同，不同的黑豆汁蒸制操作方法對制何首烏成分的影響鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用超高壓液相四極桿?飛行時間質(zhì)譜 （UPLC?Q?TOF?MS／MS） 對不同操作方法蒸制何首烏的成分整體分析，對結(jié)果進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)分析，考察不同操作方法得到的制何首烏質(zhì)量是否存在差異，找出差異顯著的成分及其在不同炮制時間過程中的動態(tài)變化，以期為規(guī)范制何首烏的炮制方法提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 6530 Accurate?Mass Q?TOF LC／MS 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國Agilent 公司）；Sartorius CP225D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；01J2003?04 型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海東亞壓力容器制造有限公司）；SB?3200D 超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 材料 生何首烏 （批號180614?1）、黑豆 （批號180614?1） 購自上海萬仕誠藥業(yè)有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)修彥鳳副教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multi?florumThunb.的干燥塊根和豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的干燥成熟種子。乙腈、甲酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黑豆汁制備 按2015 年版《中國藥典》 一部制何首烏項(xiàng)下方法［10］，取黑豆10 kg，加水適量，煮約4 h，熬汁約15 kg，藥渣再加水煮約3 h，熬汁約10 kg，合并得黑豆汁約25 kg。每100 kg 何首烏片，用黑豆10 kg。

2.2 制何首烏不同炮制品制備

2.2.1 生何首烏 取生何首烏飲片，除去雜質(zhì)，備用，標(biāo)記為0 號樣品。平行操作得到3 份樣品。

2.2.2 連續(xù)蒸何首烏 稱取9 份生何首烏片，每份300 g，分別加黑豆汁拌勻、潤透，置不銹鋼蒸鍋內(nèi)，分別蒸制一定時間（8、16、24、32、40、48、56、64、72 h），取出，稍晾，將蒸鍋內(nèi)液體濃縮，拌入何首烏中，干燥，得到9份連續(xù)蒸制不同時間的制何首烏，分別標(biāo)記為1～9 號樣品。相同蒸制時間的樣品平行制備3 份。

2.2.3 蒸悶何首烏 稱取9 份生何首烏片，每份300 g，分別加黑豆汁拌勻、潤透，置不銹鋼蒸鍋內(nèi)，蒸制加熱8 h，悶1 夜，第2 天上下翻動何首烏片，繼續(xù)蒸制8 h，悶1 夜，如此反復(fù)操作，取出，稍晾，將蒸鍋內(nèi)液體濃縮，拌入何首烏中，干燥，得到9 份蒸制不同時間（8、16、24、32、40、48、56、64、72 h） 的制何首烏，分別標(biāo)記為10～18 號樣品。相同蒸制時間的樣品平行制備3 份。

2.2.4 高壓蒸何首烏 稱取9 份生何首烏片，每份300 g，分別加黑豆汁拌勻、潤透，置蒸汽滅菌鍋內(nèi)，分別連續(xù)蒸制（100 kPa） 一定時間（4、6、8、12、16、20、24、30、36 h），取出，稍晾，將蒸鍋內(nèi)液體濃縮，拌入何首烏中，干燥，得到9 份連續(xù)蒸制不同時間的制何首烏，分別標(biāo)記為19～27 號樣品。相同蒸制時間的樣品平行制備3 份。

2.3 供試品溶液制備 分別取何首烏不同炮制品（生品、黑豆汁連續(xù)蒸品、黑豆汁蒸悶品、黑豆汁高壓蒸品） 粉碎，取細(xì)粉0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲45 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾，備用。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18保護(hù)柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸乙腈（A） -0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～32% A；5～6 min，32%～5% A；6～12 min，55%～88% A；12～15 min，88%～90% A；15～17 min，90%～100% A）；柱溫35 ℃；體積流量0.3 mL／min；進(jìn)樣量2 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m／z100～1 700；氮?dú)怏w積流量8 L／min；溫度300 ℃；毛細(xì)管電壓3.5 kV；噴嘴電壓1 000 V；碎裂電壓150 V，霧化器壓力35 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；二級質(zhì)譜碰撞能量15 eV。

2.5 不同何首烏炮制品UPLC?QTOF?MS／MS 分析 將何首烏不同炮制品的供試品溶液，注入超高壓液相色譜儀，進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)通過Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 數(shù)據(jù)處理工作站分析，各炮制品在負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1。

圖1 何首烏不同炮制品UPLC?QTOF?MS／MS 總離子流圖

圖1 表明，何首烏采用不同方法炮制后成分發(fā)生了明顯變化，成分種類的增加或減少，也有含有量方面的差異。通過進(jìn)樣分析得到的一級質(zhì)譜，確定了每種成分的相對分子量，根據(jù)二級質(zhì)譜獲得裂解信息，結(jié)合與對照品的保留時間和質(zhì)譜信息及文獻(xiàn)報(bào)道化合物的信息（比較分子離子和／或碎片離子的精確測量分子量和理論值，誤差小于10×10-6）［13?17］。共鑒定67 種成分，鑒別出43 種成分，另有24種為未知成分，見表1。

表1 何首烏不同炮制品成分鑒定

續(xù)表1

續(xù)表1

2.6 主成分分析和正交偏最小二乘法?判別分析（OPLS?DA）

2.6.1 主成分分析 為了進(jìn)一步觀察何首烏炮制前后在總體成分上的差異，采用主成分分析，初步考察黑豆汁拌入后，不同蒸制方法對何首烏的影響，不同炮制品的聚集情況，直觀表達(dá)出不同蒸制方法對成分的影響是否存在差異。由圖2 中各樣品的位置可以發(fā)現(xiàn)，0 號生何首烏與其他炮制品差異較大；與生何首烏接近的是連續(xù)蒸和蒸悶時間最短的8 h 樣品1 號和10 號；其他樣品隨著蒸制時間延長依次距離生品更遠(yuǎn)，且呈現(xiàn)聚集在一起的趨勢。主成分分析表明炮制對何首烏的質(zhì)量產(chǎn)生了明顯的影響，炮制明顯改變了何首烏的整體化學(xué)成分。制何首烏與生品質(zhì)量的差異與炮制時間有一定的相關(guān)性，隨著加工時間的延長，生、制何首烏的成分差異越大。高壓蒸制品（19～27 號） 均分布在第一、二象限，距離生品較遠(yuǎn)，與連續(xù)蒸和蒸悶法得到的樣品有一定的差異。

圖2 何首烏不同炮制品PCA?X 圖

2.6.2 OPLS?DA 根據(jù)PCA?X 分析結(jié)果，以O(shè)PLS?DA 模式對各個不同炮制品的總離子流中的峰面積進(jìn)行分析，見圖3。同樣可以發(fā)現(xiàn)，生品與各種炮制品有明顯的差異；3種方法所得樣品各自聚集在一起，連續(xù)蒸制、蒸悶品差異不明顯，部分樣品有重疊，高壓蒸制與另外2 種方法對成分的影響有明顯差異。相比較無監(jiān)督模式的主成分分析，3種方法的樣品有更大分離。

圖3 何首烏不同炮制品OPLS?DA 得分圖

2.7 何首烏蒸制過程中部分化學(xué)成分動態(tài)變化 通過UPLC?QTOF?MS／MS 分析，可以檢測到何首烏中的上千種成分，大部分成分尚未得到鑒定。為了考察拌入黑豆汁后，不同炮制方法、時間對成分的具體影響，以67 種成分的提取離子平均峰面積為指標(biāo)，采用OPLS?DA 模型分析，得到的變量權(quán)重值（VIP） ＞1.1 成分有14 種，14 種成分的VIP值大小排序?yàn)?4＞63＞50＞1＞65＞25＞2＞56＞60＞41＞58＞26＞48＞36。結(jié)果見圖4。

圖4 14 種成分在何首烏不同炮制品中的動態(tài)變化趨勢

對圖4A、4C、4E 中峰面積較高的4 種成分在炮制過程中的變化趨勢分析發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)蒸制的過程中，圖4A 中成分1、2、24 的峰面積呈現(xiàn)出蒸制8 或16 h 升高后降低，40 h 后含有量趨于穩(wěn)定，略有下降；成分65 在蒸制24 h 后緩慢升高。圖4C 中，4 種成分的變化趨勢與連續(xù)蒸制法基本一致，不同的是4 種成分的峰面積持續(xù)升高的時間延長，蒸悶40～48 h 后降低；由峰面積高度的變化也可以看出4種成分的峰面積明顯低于連續(xù)蒸制的相應(yīng)時間樣品，可能與連續(xù)蒸制有利于成分的持續(xù)轉(zhuǎn)化有關(guān)。在高壓蒸制操作的過程中，圖4E 中表現(xiàn)出各種成分的變化趨勢明顯緩和，趨勢與連續(xù)蒸制和蒸悶一致，成分1、2、65 整體略高于連續(xù)蒸制的樣品，成分24 遠(yuǎn)低于連續(xù)蒸制的樣品，與相應(yīng)時間的蒸悶品相近。

對圖4B、4D、4F 中10 種成分的變化趨勢分析發(fā)現(xiàn)，成分25、56、58、60、64 在不同方法所得炮制品中的峰面積均高于生品，成分25、56 的峰面積在3 種方法中均呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢，在連續(xù)蒸制、蒸悶24～40 h 和高壓蒸制8～16 h 后達(dá)到最高峰面積后下降；成分58、60、63 的峰面積升高后略有下降，隨時間延長基本趨緩，變化不大。其他5 種成分26、36、41、48、50 的峰面積在不同炮制方法樣品中表現(xiàn)有所不同，成分26、50 的峰面積在常壓連續(xù)蒸制、蒸悶后快速降低，而高壓蒸制8～12 h 達(dá)到最高值后降低，表明該成分的含有量變化與壓力有關(guān)系；成分48 的峰面積在3 種方法中均呈現(xiàn)蒸制8 h 增加，隨著蒸制時間延長，含有量降低；糖苷50 在連續(xù)蒸制過程中持續(xù)下降，蒸悶8 h 和高壓制12 h 后也持續(xù)下降，與糖苷在加熱過程中的分解有關(guān)系；成分36 和41 的峰面積在蒸悶8 h和高壓蒸4 h 略有升高后快速降低，連續(xù)蒸制樣品則隨著時間的延長而降低。這10 種成分在連續(xù)蒸制和蒸悶法炮制的對應(yīng)時間樣品中差別不明顯；與連續(xù)蒸制和蒸悶法所得樣品相比，高壓蒸制品中成分25、26、48、56、63 的峰面積增高，成分58 的峰面積則明顯降低，表明高壓蒸制較常壓蒸制對部分成分的轉(zhuǎn)化或溶出的影響更大。

3 討論

針對目前市場流通的制何首烏主要是采用拌入黑豆汁后蒸制，但操作方法和炮制時間不一的現(xiàn)狀，對采用連續(xù)蒸制、蒸悶交叉進(jìn)行、高壓蒸制法炮制所得制何首烏中成分進(jìn)行了整體分析，同時模仿“九蒸九曬” 的時間概念，每種操作方法制備9 個不同時間點(diǎn)樣品。采用UPLC?Q?TOF?MS／MS 分析鑒別出43 種成分，另有24 種未知成分，鑒別出的成分涵蓋了何首烏中的主要有效成分蒽醌類、二苯乙烯苷類、多酚類等。

采用主成分分析和OPLS?DA 分析了制何首烏的整體成分，何首烏經(jīng)過蒸制后發(fā)生了明顯差異，可能與蒸制過程中發(fā)生的水解、脫水、異構(gòu)化和美拉德反應(yīng)有關(guān)［13］；連續(xù)蒸制和蒸悶樣品相近，具有一定相似度，高壓制品則存在明顯差異，推測是其成分在常壓和高壓的條件下發(fā)生了程度不同的轉(zhuǎn)化。不同的操作方法會對各種成分產(chǎn)生一定的影響，炮制程度是否適宜直接影響何首烏的臨床療效。