黃芩?黃連合煎液中絡(luò)合物表征及其體外抗菌活性

柯秀梅 張立勝 李 欣 張定堃 韓 麗陳 川

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 四川成都611137； 2.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 九江市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西九江332000； 3.九江市第三人民醫(yī)院， 江西九江332000）

黃芩?黃連藥對(duì)作為清熱燥濕經(jīng)典藥對(duì)，常相須為用，共奏清熱燥濕、瀉火解毒之效［1?4］。其配伍用出自東漢張仲景《傷寒論》，之后備受醫(yī)家重用—古人常用含黃連的方劑中，約有20%～60%屬黃連黃芩配伍［5］。綜觀中醫(yī)藥經(jīng)典，黃芩?黃連同用方中其制備工藝多為合煎，如《傷寒論》 中的瀉心湯等8 個(gè)方劑；《小品方》 的犀角湯和前胡湯；《太平圣惠方》 收載的71 個(gè)黃芩?黃連同用方中，77.6%為合煎，余者制丸用；《千金翼方》 中除治療消渴的丸劑外，余者66.7%方劑均合煎；《肘后備急方》 中3 方劑均合煎。

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為自沉淀是多數(shù)藥物的有效成分，與湯藥同服會(huì)提高臨床療效［6?7］。然而，現(xiàn)代工業(yè)中，認(rèn)為黃芩?黃連合煎時(shí)黃酮和生物堿類成分發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)生的大量沉淀無(wú)效且消耗了有效成分，從而影響臨床療效。為避免沉淀的生成，特將其分開處理。2015 年版《中國(guó)藥典》 所載含黃芩?黃連配伍的中成藥工藝有兩者分煎、粉碎、滲漉等，無(wú)一合煎。如配伍有黃芩、黃連的一清膠囊／顆粒，對(duì)2 味藥的前處理為“分別加水煎煮2 次……合并煎液，濾過(guò)”；臟連丸為粉碎；葛根芩連丸／微丸／片為分別滲漉等，未見合煎者。

黃芩?黃連配伍合煎液內(nèi)，沉淀物中的小檗堿含有量約為上清液的3 倍［8?10］，但有學(xué)者認(rèn)為，湯劑中黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量的降低，并不意味著體系藥效的降低，形成的疏水性分子復(fù)合物是湯液中有效物質(zhì)的不同存在形式。課題組以黃連和黃芩中的代表性成分鹽酸小檗堿和黃芩苷為模型，探索黃芩、黃連傳統(tǒng)合煎工藝的合理性，以期豐富傳統(tǒng)沉淀性配伍的內(nèi)容。

1 材料

1.1 儀器 VERTEX70 傅里葉變換紅外光譜儀、X 射線衍射儀（德國(guó)Bruker 公司）；769YP?15A 粉末壓片機(jī)（天津市科器高新技術(shù)公司）；電子天平（德國(guó)Satouris 公司）；掃描電子顯微鏡（捷克Tescan 公司）；EON Ⅱ酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek 公司）。

1.2 試劑 肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)20161123，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）。DMSO、甲醇和乙腈均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。黃芩苷提取物和鹽酸小檗堿提取物（純度≥95%，南京澤朗生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌種 金黃色葡萄球菌ATCC23672 （NRR00571，北京華越洋生物科技有限公司）；大腸埃希菌ATCC25931（BNN3280，上海北諾生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 絡(luò)合物制備 調(diào)研中醫(yī)藥經(jīng)典發(fā)現(xiàn)，經(jīng)方中黃芩和黃連多等量配伍應(yīng)用，且2015 年版《中國(guó)藥典》 對(duì)黃芩中黃芩苷和黃連中鹽酸小檗堿的含有量要求分別為不得少于9.0%和5.0%，故課題組將此反應(yīng)中黃芩苷和鹽酸小檗堿的用量比例定為9 ∶5。分別稱取黃芩苷和鹽酸小檗堿提取物，使其以9 ∶5 的比例溶于沸水中，回流0.5 h，室溫靜置，至溶液溫度降至40 ℃，溶液中開始出現(xiàn)大量黃色絮狀沉淀物，離心，收集沉淀，于60 ℃鼓風(fēng)干燥，研末，備用。

2.2 絡(luò)合物表征

2.2.1 絡(luò)合物電子掃描顯微鏡下微觀特點(diǎn)

2.2.1.1 SEM 特點(diǎn) 取制備好的黃芩苷、鹽酸小檗堿和絡(luò)合物粉末，分別在掃描電子顯微鏡下觀察，拍攝特征圖片，結(jié)果見圖1。圖1 顯示，黃芩苷和鹽酸小檗堿共熱后微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖1 各絡(luò)合物SEM 圖

2.2.1.2 SEM?EDS 特點(diǎn) 取制備好的黃芩苷、鹽酸小檗堿和絡(luò)合物粉末，在掃描電子顯微鏡聯(lián)用能譜儀下測(cè)定表面微區(qū)元素含有量，見圖2、表1。結(jié)果表明，黃芩苷和鹽酸小檗堿沉淀過(guò)程中，丟失了Cl-。

圖2 各絡(luò)合物SEM-EDS 圖（%）

表1 各絡(luò)合物表面微區(qū)元素含有量SEM?EDS 測(cè)定結(jié)果（%）

2.3 絡(luò)合物紅外光譜特點(diǎn) 以烘干的光譜純KBr 為空白，分別制備黃芩苷、鹽酸小檗堿和沉積物的紅外測(cè)試樣品。每片中KBr 含有量為60 mg，樣品含有量約為0.8 mg，采用FTIR?360 傅里葉紅外光譜測(cè)定儀測(cè)定，結(jié)果見圖3。

紅外光譜結(jié)果表明，絡(luò)合物中黃芩苷3 488.77（vOH）、3 388 （vOH） cm-1和鹽酸小檗堿3 407 （vOH）cm-1吸收峰由于兩者酸堿中和反應(yīng)，產(chǎn)物存在共軛效應(yīng)而向低波數(shù)3 261 cm-1方向移動(dòng)。絡(luò)合物與黃芩苷、鹽酸小檗堿的波峰及強(qiáng)度有變化，有新峰產(chǎn)生，表明黃芩苷和鹽酸小檗堿在濕熱條件下發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。

圖3 各絡(luò)合物IR 圖譜

上述特征表明，黃芩苷和鹽酸小檗堿水中共熱后發(fā)生了化學(xué)變化。文獻(xiàn)報(bào)道［1?3］，有機(jī)酸和生物堿的沉淀機(jī)制是酸堿絡(luò)合。黃芩苷和鹽酸小檗堿形成沉淀的原因可能為兩者發(fā)生酸堿中和反應(yīng)形成疏水性絡(luò)合物［4?6］，逐漸沉積于湯液底部，形成沉淀。

2.4 絡(luò)合物體外抗菌活性 分別精密稱取黃芩苷提取物、鹽酸小檗堿提取物和沉積物各0.3 g，并以甲醇溶解，于96孔板各孔中分別加入180 μL 大腸埃希菌（EL） 和金黃色葡萄球菌菌液（SA），使其菌液濃度為1×105／mL。分別加入不同濃度的藥液，使黃芩苷、鹽酸小檗堿和沉積物實(shí)驗(yàn)組中各孔藥物質(zhì)量濃度為 56.250 μg／mL （高濃度）、28.125 μg／mL （中濃度）、14.063 μg／mL （低濃度）、7.032 μg／mL （極低濃度） 和0 系列濃度，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、120 r／min 搖床培養(yǎng)，分別于0、12、24 h測(cè)定各孔OD值。

2.4.1 絡(luò)合物對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑制率 于450 nm處讀取金葡菌及其對(duì)照組的OD值，并計(jì)算抑菌率，采用SPSS 21 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 各化合物對(duì)金葡菌的體外抑菌率（%，， n＝3）

表2 各化合物對(duì)金葡菌的體外抑菌率（%，， n＝3）

注：同一質(zhì)量濃度中，與絡(luò)合物組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與小檗堿比較，ΔΔP＜0.01；同一藥物組，不同質(zhì)量濃度比較，＃＃P＜0.01。

由表2 可知，絡(luò)合物、鹽酸小檗堿和黃芩苷的體外抗金葡菌活性比較，鹽酸小檗堿的活性較絡(luò)合物和黃芩苷具有極顯著優(yōu)勢(shì)，絡(luò)合物又比黃芩苷有極顯著性優(yōu)勢(shì)。各不同質(zhì)量濃度藥物組中，0 μg／mL 與其他濃度藥物組有顯著性差異外，其他各濃度藥物組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組藥物的抑菌效果在加藥12 h 后不再隨時(shí)間的延長(zhǎng)而有顯著性差異。

2.4.2 絡(luò)合物對(duì)大腸埃希菌的體外抑制率 于600 nm 處讀取金葡菌及其對(duì)照組的OD值，并計(jì)算抑菌率，采用SPSS 21 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

表3 各化合物對(duì)大腸埃希菌的體外抑菌率（%，， n＝3）

注：同一質(zhì)量濃度中，與絡(luò)合物組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與小檗堿比較，ΔΔP＜0.01。同一藥物組，不同質(zhì)量濃度比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

表3 顯示，絡(luò)合物、鹽酸小檗堿和黃芩苷的體外抗大腸埃希菌活性比較，鹽酸小檗堿的活性較絡(luò)合物和黃芩苷具有極顯著優(yōu)勢(shì)，絡(luò)合物又比黃芩苷有極顯著性優(yōu)勢(shì)。各不同質(zhì)量濃度藥物組中，0 μg／mL 與其他質(zhì)量濃度藥物組有顯著性差異外，其他各質(zhì)量濃度藥物組間均無(wú)顯著性差異。各組藥物的抑菌效果在加藥12 h 后不再隨時(shí)間的延長(zhǎng)而有顯著性差異。

3 討論

目前，中藥復(fù)方化學(xué)研究表明，水煎提取物多源自單味藥的原型成分，少有配伍煎煮中產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)的報(bào)道；而利用諸如HPLC?MS、NMR 等分析手段對(duì)復(fù)方沉淀化學(xué)成分研究，并未發(fā)現(xiàn)新的化學(xué)實(shí)體［11］。表明中藥復(fù)方水煎沉淀的原因可能是成分間的非共價(jià)結(jié)合，如范德華力、氫鍵作用、疏水作用、π-π 堆積作用和靜電作用等，這些沉淀物的結(jié)合鍵能較弱，在利用現(xiàn)代技術(shù)分析中易被破壞，故而難以檢測(cè)到。

黃芩?黃連合煎液的沉淀形成于有效成分間的相互作用，且絡(luò)合物具有明顯的抗菌活性，抗菌活性排序?yàn)辂}酸小檗堿強(qiáng)于絡(luò)合物強(qiáng)于黃芩苷。絡(luò)合物結(jié)構(gòu)中包含小檗堿和黃芩苷，理論上抑菌活性應(yīng)最強(qiáng)，但本實(shí)驗(yàn)中其活性強(qiáng)于黃芩苷而低于小檗堿，可能是由于絡(luò)合物中小檗堿的部分抑菌活性基團(tuán)在絡(luò)合過(guò)程中被掩蔽，而在黃芩苷的基礎(chǔ)上引入部分小檗堿的活性基團(tuán)，使得其活性處于兩者之間。需要結(jié)合量子化學(xué)理論和實(shí)踐，確定三者的活性基團(tuán)中心并進(jìn)行驗(yàn)證，課題組后期將進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果證明了傳統(tǒng)中醫(yī)臨床服用湯藥“溫服，合渣服用”［12?13］這一要求的科學(xué)性。若臨床用湯藥或工業(yè)提取過(guò)程中棄去沉淀，將在某種程度上造成藥物的浪費(fèi)，勢(shì)必會(huì)影響臨床療效。故聚焦于臨床療效的中藥復(fù)方水煎沉淀作為一種新型有效成分聚集體，具有潛在的藥用價(jià)值，值得深入研究。