漢黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠腎組織炎癥因子表達(dá)及TLR4／NF?κB 信號(hào)通路的影響

趙 新

（周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 河南周口466000）

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患者總數(shù)為4.25 億，而中國(guó)糖尿病發(fā)病人數(shù)位列全球第一，高達(dá)1.14 億，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì)［1］。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN） 為糖尿病最為常見(jiàn)的并發(fā)癥，30%～40%糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)DN，危害嚴(yán)重［2］。當(dāng)前，微循環(huán)障礙、糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是DN 發(fā)病的主要機(jī)制［3］。腎組織炎癥因子大量表達(dá)及TLR4／NF?κB 信號(hào)通路異常，可導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞增殖而使間質(zhì)纖維化，進(jìn)而促進(jìn)DN 的發(fā)生、發(fā)展［4?5］。漢黃芩苷為傳統(tǒng)中藥黃芩中的黃酮類單體物質(zhì)，具有降血糖、抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及保護(hù)神經(jīng)、心血管系統(tǒng)等多種藥理活性［6］。研究發(fā)現(xiàn)［7］，漢黃芩苷具有增加糖原合成改善肝胰島素抵抗及促進(jìn)HepG2 細(xì)胞葡萄糖攝取等作用，其機(jī)制與降低炎癥因子表達(dá)及激活胰島素降糖通路有關(guān)，但目前關(guān)于漢黃芩苷治療DN 的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)給予鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠不同劑量的漢黃芩苷，旨在探討其是否具有腎組織保護(hù)作用，并以腎組織炎癥因子表達(dá)及TLR4／NF?κB 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，研究其作用的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（200±20） g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （豫）2017?0001。

1.2 藥物與試劑 漢黃芩苷 （純度＞90%，批號(hào)2019021601） 購(gòu)自成都彼樣生物科技有限公司，漢黃芩苷用0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose?Na，CMC?Na） 配成10 mg／mL 混懸液，作為貯備液。STZ 購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；血糖、胰島素（insulin，INS）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿微量白蛋白（urine microalbumin albumin，UmAlb） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；血肌酐（serum creatinine，Scr） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門寶太生物科技有限公司；TNF?α、IL?1β、IL?18檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗TLR4、NF?κB p?p65、NF?κB p65 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Protein Tech公司；抗β?actin 抗體購(gòu)自中國(guó)博奧森生物有限公司。

1.3 儀器 GG?2000 型電子天平（常熟雙杰測(cè)試儀器廠）；HGM?114 型血糖儀［歐姆龍醫(yī)療器械（北京） 有限公司］；GF?D800 型半自動(dòng)生化分析儀（山東高密彩虹分析儀器有限公司）；ELX 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek 公司）；LF型蛋白電泳及轉(zhuǎn)移儀（北京龍方科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，腹腔注射STZ （60 mg／kg） 復(fù)制糖尿病大鼠模型。72 h后，測(cè)空腹血糖 （fasting blood glucose，F(xiàn)BG） 水平，當(dāng)FBG ≥16.7 mmol／L時(shí)，判斷為糖尿病模型成功建立。按體質(zhì)量將成模大鼠隨機(jī)分模型組及漢黃芩苷高、中、低劑量組，另設(shè)正常組，每組10 只。漢黃芩苷高、中、低劑量組每天以40、20、10 mg／kg 灌胃給藥，1 次／d，正常組及模型組大鼠灌胃等體積的0.5% CMC?Na，連續(xù)8 周。

2.2 標(biāo)本收集及指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集各組大鼠24 h 尿量，采用免疫比濁法檢測(cè)UmAlb 水平；乙醚麻醉大鼠后行股總動(dòng)脈采血，葡萄糖氧化酶法檢測(cè)FBG 水平，放射免疫法檢測(cè)INS 水平。血清Scr、BUN 水平及TNF?α、IL?1β、IL?18 水平采用ELISA 法測(cè)定，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)指南進(jìn)行。

2.3 HE 染色 將已經(jīng)固定好的腎臟組織制成3 μm 厚的石蠟切片，先后經(jīng)脫蠟、浸水、蘇木精染色、伊紅染色、脫水及二甲苯透明等步驟后，在光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理形態(tài)改變情況。

2.4 Western blot 檢測(cè) 取100 mg 腎臟組織，用組織蛋白裂解液500 μL 進(jìn)行勻漿處理；離心后分離上清液，BCA 法測(cè)腎組織蛋白濃度。加上樣緩沖液，煮沸變性，蛋白分離采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法。經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉及TBST 洗膜后，加入相應(yīng)的TLR4、NF?κB p?p65 及NF?κB p65 多克隆抗體，均為1 ∶2 000 稀釋，在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。常溫下，繼續(xù)加入二抗孵育1 h；化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光并經(jīng)圖像分析軟件處理，與內(nèi)參蛋白β?actin 比較，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（） 表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響 在為期8 周的給藥過(guò)程中，正常組大鼠精神狀態(tài)較佳，攝入食、水量及大小便均正常，自如移動(dòng)，反應(yīng)迅速，皮毛順滑；與正常組比較，模型組大鼠精神狀態(tài)較差，出現(xiàn)典型的多飲、多食、多尿的癥狀，活動(dòng)量明顯減少，反應(yīng)遲緩，毛色暗淡，皮毛失去光澤；經(jīng)漢黃芩苷（40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠多飲、多食、多尿癥狀有一定程度的改善，精神狀態(tài)也有好轉(zhuǎn)。如表1 所示，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低，而腎臟指數(shù)升高（P＜0.01）；與模型組比較，漢黃芩苷組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.01），而腎臟指數(shù)降低（P＜0.01）。

表1 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠FBG、INS 水平均升高（P＜0.01）；經(jīng)漢黃芩苷 （40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠FBG、INS 水平均降低（P＜0.01），見(jiàn)表2。提示漢黃芩苷可以降低糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平，具有抗糖尿病作用，且該作用呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

表2 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平的影響（， n＝10）

表2 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.3 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組大鼠UmAlb 水平及血清Scr、BUN 水平均升高（P＜0.01）；經(jīng)漢黃芩苷 （40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠UmAlb水平及血清Scr、BUN 水平均降低（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)的影響（， n＝10）

表3 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響 如圖1 所示，正常組大鼠腎臟無(wú)纖維組織增生及基底膜增厚，系膜細(xì)胞和基質(zhì)無(wú)增殖，腎小球和腎小管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，腎組織結(jié)構(gòu)清晰完整、形狀規(guī)則；模型組大鼠可見(jiàn)胞外基質(zhì)增生，系膜細(xì)胞增殖，系膜擴(kuò)張，腎小球肥大和腎小球基底膜增厚，部分腎小管萎縮等現(xiàn)象。漢黃芩苷各給藥組與模型組比較，病理形態(tài)均有一定程度的改善，其中漢黃芩苷（40 mg／kg） 效果最好，改善最為明顯。

3.5 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠血清TNF?α、IL?1β 及IL?18水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平均升高（P＜0.01）；經(jīng)漢黃芩苷（40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表4。此結(jié)果可初步說(shuō)明，漢黃芩苷可抑制糖尿病模型大鼠血清中細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)緩解糖尿病模型大鼠的腎臟損傷。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)（HE，×40）

3.6 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎組織TLR4／NF?κB 信號(hào)通路的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01），而NF?κB p65 蛋白表達(dá)無(wú)變化 （P＞0.05）；經(jīng)漢黃芩苷 （40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01），而NF?κB p65 蛋白表達(dá)無(wú)變化（P＞0.05），見(jiàn)圖2、表5。此結(jié)果可進(jìn)一步說(shuō)明，漢黃芩苷可抑制糖尿病模型大鼠腎組織TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4／NF?κB 信號(hào)通路發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

表4 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠血清TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平的影響（， n＝10）

表4 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠血清TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平的影響（， n＝10）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖2 Western blot 法檢測(cè)TLR4／NF?κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎組織TLR4／NF?κB 信號(hào)通路的影響（， n＝10）

表5 漢黃芩苷對(duì)糖尿病模型大鼠腎組織TLR4／NF?κB 信號(hào)通路的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

4 討論

DN 是由腎臟供血的毛細(xì)血管受到損傷而導(dǎo)致的一種炎癥性疾病，降低血清中的炎癥因子TNF?α、IL?1β 及IL?18等的水平有利于DN 的治療［8］。TNF?α、IL?1β 及IL?18 等炎癥因子的表達(dá)與腎小球?yàn)V過(guò)率變化、內(nèi)皮通透性改變、血流動(dòng)力學(xué)降低、單核巨噬細(xì)胞聚集等密切相關(guān)［9］。既往研究［10］表明，漢黃芩苷能在轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)抑制佛波酯誘導(dǎo)的人單核THP?1 細(xì)胞中Nod 樣受體蛋白3 及IL?1β 的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。此外，漢黃芩苷也可以通過(guò)降低TNF?α、IL?6等的表達(dá)，抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥反應(yīng)［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，漢黃芩苷各組大鼠TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平均明顯降低，提示漢黃芩苷可抑制糖尿病模型大鼠血清中細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)緩解糖尿病模型大鼠的腎臟損傷。

TLR4／NF?κB 信號(hào)通路在各種炎癥因子相互作用和相互影響的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中起著中心調(diào)控作用。Toll 樣受體可激活多種細(xì)胞因子，其位于NF?κB 信號(hào)通路的上游，進(jìn)而誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)［12］。在DN 發(fā)展過(guò)程中，作為激活炎癥信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)分子TLR4 和NF?κB，其過(guò)度活化或表達(dá)水平上調(diào)，是誘發(fā)糖尿病腎損傷的重要分子機(jī)制［13］。漢黃芩苷可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，其機(jī)制與抑制TLR4 介導(dǎo)的NF?κB 炎癥信號(hào)通路中IκB 和NF?κB p65 蛋白的磷酸化表達(dá)有關(guān)［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，漢黃芩苷各組大鼠TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達(dá)均明顯降低，提示漢黃芩苷可抑制糖尿病模型大鼠腎組織TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4／NF?κB 信號(hào)通路發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上，漢黃芩苷具有抑制炎癥因子表達(dá)及調(diào)控TLR4／NF?κB 信號(hào)通路的作用，該作用是發(fā)揮保護(hù)糖尿病模型大鼠腎組織損傷功能的重要機(jī)制。