尪痹片HPLC 指紋圖譜建立

於慧佳 董紅陽 孫立新

（沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧本溪117004）

尪（音同“王” ） 痹片由地黃、熟地黃、續(xù)斷、附子（黑順片）、獨(dú)活、骨碎補(bǔ)、桂枝、淫羊藿、防風(fēng)、威靈仙、皂角刺、羊骨、白芍、狗脊 （制）、知母、伸筋草、紅花17 味藥材組成，方中續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、狗脊、羊骨、附子、淫羊藿、地黃、熟地黃共為君藥，桂枝、獨(dú)活、防風(fēng)、威靈仙共為臣藥，白芍、知母、伸筋草、皂角刺、紅花共為佐藥，可治療肝腎不足、風(fēng)濕阻絡(luò)所致的尪痹，癥見肌肉、關(guān)節(jié)疼痛等，以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎見有上述證候者［1］，它具有鎮(zhèn)痛抗炎等藥理作用［2?6］，對多種風(fēng)濕骨病行之有效［7?15］。在2015 年版《中國藥典》 一部中，尪痹片質(zhì)量控制僅規(guī)定了TLC 定性鑒別和淫羊藿苷含有量測定，無法全面控制該制劑質(zhì)量。

中藥指紋圖譜能反映中藥可測成分的整體質(zhì)量信息，整體評價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立尪痹片HPLC 指紋圖譜，并通過主成分分析評價(jià)該制劑質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 LC?20AT 型高效液相色譜儀（配置SPD?M20A型二極管陣列檢測器、CBM?20A 型控制器、Labsolution 色譜工作站，日本島津公司）；JF1004 型電子天平（萬分之一，余姚市金諾天平儀器有限公司）；TG332A 型微量分析天平（十萬分之一，湘儀天平儀器廠）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 尪痹片［遼寧好護(hù)士藥業(yè)（集團(tuán)） 有限公司，批號161007、161116、160710、161018、161216、170209、161209、160315、151208、160605，編號S1～S10，0.5 g／片］。原兒茶酸（批號110809?201205）、原兒茶醛（批號110810?201608）、芍藥苷（批號110736?201741）、淫羊藿苷（批號110737?201516） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；馬錢苷酸（批號M?008?180102） 對照品購自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙酸、甲醇、乙腈為色譜純（百靈威科技有限公司）；純化水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1%乙酸（B），梯度洗脫（0～12 min，5%～10% A；12～16 min，10%A；16～18 min，10%～12%A；18～33 min，12%～14%A；33～40 min，14%～18% A；40～60 min，18%～25% A；60～80 min，25%～40%A；80～90 min，40%～80%A；90～95 min，80%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長235 nm；進(jìn)樣量5 μL。在此條件下，理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均不低于5 000，各成分色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.2。

2.2 供試品溶液制備 將片劑去包衣后研細(xì)，精密稱取粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 25%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（250 W、33 kHz） 提取30 min，放冷，25%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，25%甲醇制成分別含原兒茶酸103.5 μg／mL、馬錢苷酸398.9 μg／mL、原兒茶醛47.9 μg／mL、芍藥苷1 910.2 μg／mL、淫羊藿苷179.0 μg／mL 的溶液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液 （批號161007），在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，以6 號峰（馬錢苷酸） 為參照測定各共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD，測得兩者分別為0.16%～1.2%、0.83%～1.9%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品 （批號161007） 6份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以6 號峰（馬錢苷酸） 為參照測定各共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD，測得兩者分別為0.14%～0.83%、0.97%～1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液 （批號161007），于0、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以6 號峰（馬錢苷酸） 為參照測定各共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD，測得兩者分別為0.13%～1.5%、0.69%～1.8%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜生成 取10 批片劑，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，建立指紋圖譜，結(jié)果見圖1，再采用中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版） 生成對照指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)有26 個(gè)共有峰，見圖2，其中6 號峰（馬錢苷酸） 分離度較好，峰面積較穩(wěn)定，故選擇其作為參照峰（S）。經(jīng)與對照品比對后，峰5、6、7、14、22 分別為原兒茶酸、馬錢苷酸、原兒茶醛、芍藥苷、淫羊藿苷。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖2 對照指紋圖譜

2.6 指紋圖譜評價(jià)

2.6.1 相似度分析 通過中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版），對10 批樣品進(jìn)行相似度評價(jià)，S1～S10 相似度分別為 0.980、0.987、0.981、0.990、0.991、0.970、0.979、0.977、0.876、0.983，可知各批樣品質(zhì)量比較穩(wěn)定。

2.6.2 主成分分析 通過SPSS 22.0 軟件，以26 個(gè)共有峰面積標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值為變量，計(jì)算主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率，結(jié)果見表1。由此可知，前3 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為65.651%，而前5 個(gè)為86.042%，由于變量多，故只取前3 個(gè)，可代表指紋圖譜共有峰的大部分信息。

表1 主成分特征值及貢獻(xiàn)率

將3 個(gè)主成分進(jìn)行排序，結(jié)果見圖3。由此可知，19、14、26、16、25、7、11、3 號峰對主成分1 有顯著貢獻(xiàn)（依次降低），24、23、13、9 號峰對主成分2 有顯著貢獻(xiàn)，6、10 號峰對主成分3 有顯著貢獻(xiàn)，即不同批次樣品的質(zhì)量差異主要體現(xiàn)在這14 種成分含有量上。其中，14 號峰（芍藥苷）、7 號峰（原兒茶醛）、6 號峰（馬錢苷酸） 為重要參數(shù)，并且分別為佐藥白芍、君藥狗脊、君藥續(xù)斷的特征性成分。

圖3 3 個(gè)主成分排序坐標(biāo)圖

對主成分載荷值進(jìn)行計(jì)算，得到線性模型，代入各相關(guān)數(shù)據(jù)后得到主成分得分及綜合得分，結(jié)果見圖4。由此可知，主成分1 中得分較高的是S2、S4、S6，主成分2 中得分較高的是S5、S7，主成分3 中得分較高的是S3、S4，綜合得分排名依次為S4＞S2＞S5＞S3＞S6＞S1＞S7＞S8＞S9＞S10，其中生產(chǎn)日期較近的批次主成分得分較高，而生產(chǎn)日期較遠(yuǎn)的相對較低，即前者質(zhì)量更好。另外，不同批號樣品中的藥材產(chǎn)地、來源有一定差異，也導(dǎo)致其質(zhì)量有所不同。

圖4 主成分得分、綜合得分排序坐標(biāo)圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)篩選提取溶劑時(shí)考察了水、甲醇（25%、50%、75%、100%）、乙醇 （25%、50%、75%、100%），發(fā)現(xiàn)25%甲醇提取效果最佳，各成分提取均較充分；考察加熱、超聲提取，發(fā)現(xiàn)兩者提取效果相當(dāng)，故選擇更簡單易行的后者；考察了提取時(shí)間、料液比，發(fā)現(xiàn)兩者分別為30 min、1 ∶20 時(shí)提取效率最高；考察了不同流動相比例、色譜柱、體積流量、柱溫，確定“2.1” 項(xiàng)下色譜條件。

然后，建立了10 批尪痹片的HPLC 指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)有9 批相似度大于0.97，表明其質(zhì)量比較一致；樣品S9 相似度為0.876，而它為2015 年生產(chǎn) （有效期至2018 年11月），可能主要是存儲時(shí)間較長導(dǎo)致質(zhì)量有所差異。主成分分析采用降維模式，將反映HPLC 指紋圖譜的多維特征參數(shù)用3 個(gè)主成分表示，可為尪痹片質(zhì)量評價(jià)提供參考。