高通量測序分析五倍子發(fā)酵用酒曲與酒糟微生物多樣性

黎江華 劉超蘭 馮 興 楊曉雁 郭義東

（成都大學(xué)， 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川成都610052）

傳統(tǒng)中藥百藥煎是由五倍子經(jīng)發(fā)酵制備而成，其始載于《丹溪心法》，炮制方法則最早被記載于《本草蒙筌》，另在《醫(yī)學(xué)入門》 《本草綱目》 等亦有記載。然歷代文獻記載的發(fā)酵制法中主要輔料為酒麯或酵糟或兩者均未加入；另有桔梗、甘草，水紅廖、烏梅煎，細茶，小廖汁、細茶及真茶汁加入之異［1］。進一步查閱歷版《中國藥典》、全國各地炮制規(guī)范，僅浙江、四川和江西中藥炮制規(guī)范及北京中藥材標準，京幫、武漢文幫記載了其炮制方法，同樣存在輔料的不同記載，如北京用白酒曲，浙江和四川用酒糟，江西用米酒等［1?5］，尚無規(guī)范化、標準化的百藥煎的制備工藝。目前，已有文獻對五倍子發(fā)酵過程中酒曲的篩選和發(fā)酵工藝優(yōu)化進行了報道［6?7］，探討了綠茶及其不同加入方式對五倍子發(fā)酵的影響［8］，而主要輔料酒曲與酒糟的差異性相關(guān)研究報道較少，且兩者的微生物多樣性差異分析尚無報道。

傳統(tǒng)研究微生物方法多為分離培養(yǎng)法，分離得到的微生物在種類和數(shù)量上均有限；隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展成熟，尤其是高通量測序技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用，已逐步成為微生物研究領(lǐng)域強有力的工具。該方法無需培養(yǎng)分離菌群，卻能方便快捷、客觀還原實驗樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)，并已成熟應(yīng)用到環(huán)境微生物［9］、茶葉發(fā)酵微生物［10］、食醋與酒等釀造微生物［11?12］的分析。因此，本實驗以宜賓某酒廠生產(chǎn)白酒前后的酒曲與酒糟為研究對象，擬采用高通量測序技術(shù)對比分析兩者的微生物多樣性。以期通過微生物多樣性的差異分析，探討主要輔料不同而均能得到百藥煎（五倍子發(fā)酵品） 的科學(xué)依據(jù)，以期為后續(xù)建立五倍子發(fā)酵百藥煎的微生物體系指標（功能微生物群） 及進一步優(yōu)化其制備工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 材料 酒曲與酒糟樣品取自四川省宜賓市某濃香型白酒酒廠。Tris?酚購于美國Sigma 公司；RNA 酶、Ex Taq 酶購于日本TaKaRa Biotechnology公司。GeneJET 膠回收試劑盒購于美國Thermo Sci?entific 公司；Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒購于美國Life 公司。氯仿、異戊醇、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器 MastercyclerPCR 儀 （德國Eppendorf公司）；PowerPac3000 電泳儀 （美國Bio?Rad 公司）；Iontorrent 高通量測序平臺、Pico?21 臺式離心機（美國Thermo Fisher 公司）；GL?88B 漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 樣品準備 分別取酒廠的酒曲與酒糟各約10 g，迅速粉碎并密封于無菌袋中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 樣品基因組DNA 提取 采用CTAB 法分別提取酒曲與酒糟中微生物基因組DNA。具體步驟為樣品預(yù)處理，CTAB 法提取緩沖液，采用Tris酚、氯仿、異戊醇抽提，異丙醇沉淀，70%乙醇洗滌，DNA 溶解及RNA 酶酶解等。再用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 PCR 擴增及高通量測序 利用引物（341F、806R） 和引物（ITS1F、ITS2R） 分別對細菌16S rDNA 的V3?V4 區(qū)和真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔ITS1 區(qū)進行PCR 擴增，產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測回收，并用GeneJET 膠回收試劑盒純化，利用單端測序的方法，構(gòu)建小片段文庫，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，再采用IonS5TMXL 測序平臺進行上機測序（北京諾禾致源科技股份有限公司）。

2.1.4 序列數(shù)據(jù)處理與分析 使用Cutadapt（V1.9.1） 對Reads 進行過濾，截去Barcode 和引物序列并去除嵌合體序列，得到最終的Clean Reads［13］；利用 Uparse 軟件 （V7.0.1001） 對Clean Reads 在97%的相似度水平下進行聚類成為OTU （Operational taxonomic unit）［14］。根據(jù)OTU 的聚類結(jié)果，以SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫對OTU 序列進行物種注釋分析［15］，獲得分類學(xué)信息和酒曲與酒糟在不同分類水平上的菌群組成，用柱狀圖或餅圖進行可視化。同時，使用Qiime （V1.9.1） 進行OTU豐度與Alpha 多樣性指數(shù)的計算。

2.2 結(jié)果

2.2.1 樣品OTU 聚類分析 由表1 可知，本次高通量測序結(jié)果充分反映了酒曲與酒糟的微生物多樣性。酒曲中得到的可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的細菌有效序列80 065 條，有效率為95.92%；真菌的有效序列31 898，有效率為95.71%。酒糟中得到的可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的細菌有效序列80 096 條，有效率為97.32%；真菌的有效序列21 504，有效率為97.01%。酒曲與酒糟中細菌的ACE 和Chao1 指數(shù)均大于真菌，表明兩者中細菌菌群豐富度大于真菌菌群，提示細菌可能將在后續(xù)的五倍子發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的作用。從Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)來看，酒曲與酒糟中細菌群落的多樣性也高于真菌，且酒糟的細菌和真菌菌群的多樣性均高于酒曲。另外，兩者Coverage 指數(shù)都非常接近1，表明本實驗測序結(jié)果能真實有效地反映酒曲與酒糟中微生物多樣性。

表1 樣品OTU 聚類和多樣性指數(shù)Tab.1 OTU clustering and diversity index of samples

2.2.2 樣品OTU 物種統(tǒng)計 將酒曲與酒糟中OTU以門、綱、目、科、屬、種的秩序依次進行分類信息統(tǒng)計，分析兩者在各水平上的菌群結(jié)構(gòu)，見表2。

表2 樣品各分類水平OTU 物種統(tǒng)計Tab.2 Statistics of OTU species in each grade samples

由表2 可知，本研究的酒曲樣品中細菌菌群分布在6 個門、9 個綱、18 個目、23 個科、29 個屬中；真菌菌群分布在在4 個門、6 個綱、10 個目、16 個科、21 個屬中。而酒糟樣品中細菌菌群則分布在9 個門、12 個綱、25 個目、36 個科、56 個屬中；真菌菌群則分布在4 個門、9 個綱、14 個目、19 個科、28 個屬中。以上結(jié)果進一步表明，酒曲與酒糟中細菌菌群多樣性均高于真菌菌群，且酒糟中細菌與真菌菌群多樣性則分別高于酒曲。另外，表2 中顯示酒曲與酒糟中微生物種水平的數(shù)據(jù)比屬水平少，特別是細菌種屬表現(xiàn)尤為明顯，這可能與16S rDNA 對于親緣關(guān)系較近的種屬分辨率不高，部分微生物的分類鑒定僅到屬水平相關(guān)；但采用16S rDNA 和ITS 的高通量測序法基本可在屬及以上水平準確劃分微生物［16］。

2.2.3 樣品中微生物在門水平的組成 對酒曲與酒糟中微生物在門分類水平上進行分析，并將菌群豐度大于或等于1% 劃分為優(yōu)勢菌門，其他菌門（豐度＜1.0%） 歸納為其他（Others），結(jié)果見圖1。酒曲細菌群主要包括厚壁菌門 （Firmicute，72%）、變形菌門 （Proteobacteria，20%） 及擬桿菌門（Bacteroidetes，7%），其他細菌菌門豐度值均小于1% （圖1 S1?B）；真菌群主要包括接合菌門 （Zygomycota，64%）、擔(dān) 子 菌 門（Basidiomycota，25%）、子囊菌門 （Ascomycota，10%），其他真菌菌門豐度值小于1% （圖1 S1?F）。酒糟細菌群主要包括厚壁菌門（Firmicute，38%）、放線菌門（Actinobacteria，24%）、變形菌門（Proteobacteria，22%）、藍細菌門（Cyanobac?teria，8%）、擬桿菌門 （Bacteroidetes，1%），另有未得到分類學(xué)注釋的菌群豐度值為5%，其他細菌菌門豐度值均小于1% （圖1 S2?B）；真菌群主要包括擔(dān)子菌門（Basidiomycota，57%）、子囊菌門（Ascomycota，25%）、接合菌門 （Zygomycota，9%），另有未得到分類學(xué)注釋的菌群豐度值為8%，其他真菌菌門豐度值小于1% （圖1 S2?F）。相對于酒曲，酒糟中細菌在門分類水平上還包括相對豐度值較大的放線菌門和藍細菌門，并有未得到分類學(xué)注釋的菌群；而真菌群中兩者在門分類水平上種類差異較小，但各菌門的相對豐度值差異較大。

圖1 樣品中細菌和真菌在門水平分布圖Fig.1 Bacteria and fungus species distribution map of samples in the phylum lever

2.2.4 樣品中微生物在屬水平的組成 由于高通量測序技術(shù)分析酒曲與酒糟檢測出大量微生物，多數(shù)菌群相對豐度值較低，為方便直觀查看，擬選擇在屬水平上的優(yōu)勢菌屬（豐度≥1.0%） 進行統(tǒng)計，其他菌門 （豐度＜1.0%） 同樣歸納為其他（Others），結(jié)果見圖2。

酒曲中細菌屬的分類水平按其豐度值排序，主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus，31%）、魏斯氏菌屬 （Weissella，15%）、芽孢桿菌屬 （Bacillus，11%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，9%）、片球菌屬（Pediococcus，8%）、食單胞菌屬 （Stenotroph?omonas，2%）、Chishuiella（7%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus，5%）、克雷伯菌屬 （Klebsiella，2%） 及泛菌屬（Pantoea，1%） 等，其他菌群豐度均小于1%，約占總菌群豐度的9% （圖2 S1?B）。酒曲中乳酸菌作為優(yōu)勢細菌對于白酒中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要［17］。真菌屬則主要包括根霉屬（Rhizopus，64%）、絲孢酵母屬（Trichosporon，24%）、假絲酵母屬 （Candida，3%）、曲霉屬（Aspergillus，2%）、伊薩酵母屬 （Issatchenkia，2%）、嗜熱真菌屬 （Thermomyces，1%）、熱子囊菌屬（Thermoascus，1%） 等；其他菌群豐度均小于1%，約占總菌群豐度的3% （圖2 S1?F）。已有學(xué)者通過優(yōu)選百藥煎的炮制工藝研究，發(fā)現(xiàn)以根霉曲發(fā)酵五倍子的發(fā)酵效果最好［7］，而本實驗檢測出酒曲中根霉屬真菌相對豐度高達64%，是否意味著酒曲中根霉屬真菌為五倍子發(fā)酵百藥煎的功能微生物及酒曲中的細菌菌群，在發(fā)酵過程中的作用均需進一步研究。

圖2 樣品中細菌和真菌在屬水平分布圖Fig.2 Bacteria and fungus species distribution map of samples in the genus level

酒糟中細菌屬的分類水平按其豐度值排序，主要包括魏斯氏菌屬（Weissella，11%）、未定義藍細菌（Unidentified Cyanobacteria，8%）、芽孢桿菌屬 （Bacillus，7%）、食 單 胞 菌 屬（Stenotrophomonas，7%）、葡萄球菌屬 （Staphylo?coccus，6%）、短桿菌屬 （Brevibacterium，5%）、短狀桿菌屬 （Brachybacterium，4%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，3%）、微桿菌屬 （Microbacterium，3%）、馬賽菌屬（Massilia，2%）、腸球菌屬（En?terococcus，2%）、片球菌屬 （Pediococcus，2%）、微球菌屬 （Micrococcus，2%）、庫克菌屬（Kocuria，2%）、纖維菌屬 （Cellulosimicrobium，2%）、巨球菌屬（Macrococcus，1%） 及擬桿菌屬（Bacteroides，1%） 等，另有未得到分類學(xué)注釋的菌群豐度為5%，其他菌群豐度占總菌群豐度的27% （圖2 S2?B）。真菌屬則主要包括絲孢酵母屬（Trichosporon，34%）、伊薩酵母屬 （Issatchenkia，9%）、Cutaneotrichosporon（8%）、Naganishia（7%）、根霉屬 （Rhizopus，5%）、毛霉屬（Mucor，4%）、Papiliotrema（2%）、威克漢姆酵母屬 （Wickerhamomyces，2%）、畢 赤 酵 母 屬（Pichia，2%）、紅酵母屬 （Rhodotorula，2%）、Apiotrichum（1%）、鐮刀菌屬 （Fusarium，1%）、Diutina（1%）、鏈格孢屬（Alternaria，1%）、散囊菌屬（Eurotium，1%）、曲霉屬（Aspergillus，1%）等，另有未得到分類學(xué)注釋的菌群豐度為12%，其他菌群豐度占總菌群豐度的6% （圖2 S2?F）。從真菌屬的分類水平來看，酒糟中主要優(yōu)勢真菌屬包括絲孢酵母屬和伊薩酵母屬，其中絲孢酵母屬是一種非釀酒酵母，但其具有豐富的酶系（如蛋白酶和脂肪酶），可以參與并促進葡萄酒發(fā)酵而形成特有的品質(zhì)與風(fēng)味［18］。

2.2.5 樣品OTU?Venn 圖 從圖3 中可知，酒曲與酒糟中高相似度細菌OTU 有90 個，占酒曲總OTU 的84.11%，占酒糟總OTU 的22.84%；而高相似度真菌OTU 有65 個，占酒曲總OTU 的85.53%，占酒糟總OTU 的35.52%。

圖3 樣品中細菌和真菌OTU?Venn 圖Fig.3 OTU?Venn of bacteria and fungus species in samples

高相似度細菌和真菌OTU 數(shù)占酒曲總OTU 的比均較高，表明酒曲與酒糟共同的菌群可能是酒曲自有的微生物，也可能是宜賓地區(qū)酒曲特有的微生物體系，這與當(dāng)?shù)氐闹魄毦叩赜蛐蕴厣芮邢嚓P(guān)。而對于酒曲和酒糟間存在微生物體系的較大差異性，則可能與廠家發(fā)酵生產(chǎn)白酒的環(huán)境（原料、用水、空氣、窖池等） 及樣品的加工與儲存環(huán)境相關(guān)。因此可以認為，酒曲與酒糟中微生物的多樣性，不僅與所處的地理環(huán)境有關(guān)，還可能與白酒生產(chǎn)過程、樣品的加工與儲存有緊密聯(lián)系。

3 討論

本實驗采用高通量測序技術(shù)系統(tǒng)分析了同一酒廠的酒曲與酒糟細菌和真菌菌群結(jié)構(gòu)。Alpha 多樣性分析結(jié)果表明，2 樣品的測序深度均足以覆蓋其微生物的種類，也能有效地反映其微生物的多樣性。OTU 物種統(tǒng)計結(jié)果表明，酒曲與酒糟中細菌菌群多樣性均高于真菌菌群，且酒糟中細菌與真菌菌群多樣性則分別高于酒曲。對微生物的相對豐度進行統(tǒng)計表明，在門的分類水平上酒曲與酒糟真菌菌群的種類差異較小但各菌門的相對豐度差異較大；相比于酒曲，酒糟細菌菌群多了放線菌門和藍細菌門。在屬的分類水平上，酒曲中的優(yōu)勢細菌類群主要包括乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬等，而酒糟中優(yōu)勢細菌類群則主要包括魏斯氏菌屬、未定義藍細菌、芽孢桿菌屬等，兩者中細菌菌群種類和相對豐度均差異較大。對于兩者的真菌菌群，酒曲中優(yōu)勢真菌主要為根霉屬、絲孢酵母屬、假絲酵母屬等，而酒糟中優(yōu)勢真菌主要為絲孢酵母屬、伊薩酵母屬、Cutaneotrichosporon等，且兩者中真菌菌群種類和豐度也差異較大。此外，酒糟中檢測出部分未得到分類學(xué)注釋的微生物。

根據(jù)各省炮制工藝操作，酒曲與酒糟均可作為五倍子發(fā)酵生成百藥煎的主要輔料（占全處方量的19.05%），然而同一酒廠的酒曲與酒糟中微生物物種存在較大差異。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒糟的微生物物種較酒曲豐富，主要由于其微生物多樣性反映的是白酒釀造全過程的微生物菌群結(jié)構(gòu)，特別是與窖泥中豐富的微生物有關(guān)。高通量測序技術(shù)是對DNA 分子進行序列測定，與樣品中微生物是否為活菌無關(guān)。酒糟，別名紅糟、酒醅糟、粕等，實為釀酒后剩余的殘渣，在酒醅形成酒糟的過程中有個高溫蒸餾環(huán)節(jié)，多數(shù)不耐高溫的細菌和真菌則可能會被殺死，相反酒曲則可能帶有更多活菌參與發(fā)酵過程。加之酒曲與酒糟因來源不同而提供給微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)及類型也存在差異，但兩者均可參與五倍子發(fā)酵形成百藥煎，其科學(xué)依據(jù)及兩者在參與五倍子的發(fā)酵過程中，其“異中有同” 的關(guān)鍵均是進一步研究關(guān)注的重點。另外，本次測序分析發(fā)現(xiàn)酒曲中有相對豐度值較大的葡萄球菌屬和克雷伯菌屬細菌，它們?yōu)槭吃葱灾虏∥⑸铮赡芤蚓魄谏a(chǎn)、運輸及儲存過程中污染所致。

目前，雖已有五倍子發(fā)酵百藥煎的發(fā)酵工藝優(yōu)化研究，但是不同文獻報道酵曲的選擇不一，然而選擇何種酵曲才能使發(fā)酵效果更好并確保臨床用藥安全有效仍有待于深入研究。本研究采用高通量測序技術(shù)對酒曲與酒糟中的菌群結(jié)構(gòu)進行分析，該技術(shù)能較全面反映樣品中微生物多樣性，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法相比具有一定優(yōu)勢，以期為繼續(xù)深入研究酒曲與酒糟對五倍子發(fā)酵百藥煎的影響，特別是對發(fā)酵過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性、演替規(guī)律及發(fā)酵功能等影響提供參考，同時也為后續(xù)結(jié)合化學(xué)成分和藥理作用的變化研究，建立五倍子發(fā)酵百藥煎的微生物體系指標（功能微生物群） 及進一步優(yōu)化其制備工藝奠定基礎(chǔ)。