山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC 指紋圖譜建立及5 種成分測定

王子怡 李艷榮 杜義龍 趙勝男 潘海峰

（承德醫(yī)學(xué)院河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北承德067000）

山楂葉為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.Var.majorN.E.Br.或山楂Cra?taegus pinnatifidaBge.的干燥葉［1］。山楂葉主要成分為三萜和黃酮類，以山楂葉總黃酮類研究較多見［2?3］。目前，關(guān)于山楂葉的研究多集中在藥理作用［4?6］和藥材的指紋圖譜［7］及多組分含有量測定［8?9］等方面，關(guān)于山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究報(bào)道較少。

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為一種標(biāo)準(zhǔn)體系，有效地規(guī)范了臨床飲片形式［10］。鑒于中藥大多具有化學(xué)成分復(fù)雜，且湯劑質(zhì)量不能僅僅依賴簡單的定性及定量，需要對標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量進(jìn)行整體控制，指紋圖譜是符合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制模式之一。指紋圖譜通過共有峰標(biāo)定和相似度評價(jià)等較全面的體現(xiàn)中藥的整體性［11］，多指標(biāo)成分的同步測定可明確其含有量［12］。課題組前期對山楂葉指紋圖譜［13?14］及多組分含有量測定［15?16］進(jìn)行了系統(tǒng)研究，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上選取不同產(chǎn)地的16 批山楂葉制成標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立HPLC 指紋圖譜［17?18］，并對5 種黃酮類成分進(jìn)行含有量測定，以期為山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AG?245 型電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；JA2003 上皿天平（千分之一，上海精密科學(xué)儀器天平儀器廠）；HC?2062高速離心機(jī) （科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。甲醇和乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。對照品綠原酸（161217）、牡荊素葡萄糖苷（171403），均購于成都普菲得生物技術(shù)有限公司；對照品牡荊素鼠李糖苷（111668?2000602），購于中國食品藥品檢定研究院；對照品蘆丁 （120226）、金絲桃苷（161231），均購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

山楂葉藥材（存放在承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所）由承德民族師范學(xué)院董建新教授鑒定為正品。信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent Extend?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.2%甲酸?乙腈（A?B），梯度洗脫（0～10 min，8%B；10～20 min，15% B；20～60 min，35% B；60～70 min，60% B；70～90 min，90% B）；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL／min；檢測波長320 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.2 溶液制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑 參考文獻(xiàn)［10］，取100 g山楂葉粗粉，加蒸餾水1 200 mL 第1 次浸泡30 min后加熱回流30 min，趁熱過3 層紗布；殘?jiān)尤? 000 mL蒸餾水進(jìn)行20 min 回流，合并2 次濾液，45 ℃減壓濃縮至500 mL，即得綠色或棕色質(zhì)量濃度為0.2 g／mL的標(biāo)準(zhǔn)湯劑，可在-41 ℃冷凍干燥至粉末狀。

2.2.2 供試品溶液 取經(jīng)過超速離心10 min 處理的2 mL 山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑與16%乙腈1 ∶1混合溶液的上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 混合對照品溶液 甲醇溶解對照品，分別制得含各對照品0.717、0.723、1.05、1.103、1.100 mg／mL 作為貯備液。精密制備含綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、蘆丁、金絲桃苷分別為286、286、840、264、176 μg／mL 的混合對照品溶液。

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 方法學(xué)考察

2.3.1.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，測得各共有峰相對保留時間RSD 及相對峰面積RSD （牡荊素葡萄糖苷作為參照），均小于0.80%。表明儀器精密度良好。

2.3.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、4、6、8、10、24 h 進(jìn)樣，測得各共有峰相對保留時間RSD、相對峰面積RSD 均小于2.0%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份S4 山東東營批次供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得各共有峰相對峰面積RSD 及相對保留時間RSD 均小于1.0%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.2 指紋圖譜建立 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A 版” 對HPLC 所得色譜圖進(jìn)行處理，以山東泰安樣品的色譜圖為參照，建立山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC 指紋圖譜色譜疊加圖，對照圖譜以中位數(shù)法生成。見圖1。

圖1 16 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of sixteen batches of samples

2.3.3 相似度分析 相似度分析結(jié)果見表2。

表2 16 批樣品相似度Tab.2 Similarities of sixteen batches of samples

2.4 數(shù)據(jù)分析

2.4.1 主成分分析 本實(shí)驗(yàn)通過SPSS 21.0 進(jìn)行主成分分析，并對18 個共有峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。以3 個主成分分別作為X、Y、Z軸，通過投影可得到16 批山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑主成分分析圖，見圖2。16 批山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑分為3 類，S1 批為一類，S3 和S7 批為一批，其他為另一批。

圖2 16 批樣品主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis plot for sixteen batches of samples

2.4.2 聚類分析 本實(shí)驗(yàn)以18 個共有峰為變量，采用SPSS 21.0 組間連接平方Euclidean 距離的聚類方法，進(jìn)行聚類分析。結(jié)果見圖3。以類間距為指標(biāo)，在15～25 之間，S1 為一類，其余批次為一類；10～15 之間時S7 批單獨(dú)成一類；0～8 時S3 為一類，其他為一類。

圖3 16 批樣品聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of sixteen batches of samples

2.4.3 共有峰模式建立 通過化學(xué)模式識別研究，從16 批山楂葉藥材中篩選出S2、S4、S5、S6、S08～S16 共13 批藥材較穩(wěn)定，可用于山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制。將這13 批色譜圖進(jìn)行相似度分析，建立了13 批樣品的指紋圖譜共有模式，見圖4，共標(biāo)定出21 個共有峰，相似度均大于0.95。見圖5。

圖4 13 批樣品HPLC 指紋圖譜共有模式Fig.4 Common pattern of HPLC fingerprints of thirteen batches of samples

圖5 山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有模式Fig.5 Common pattern of fingerprint of hawthorn leaves standard decoction

2.4.4 共有峰指認(rèn) 取“2.2.3” 項(xiàng)下混合對照品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，所得色譜圖與對照圖譜中的色譜峰進(jìn)行指認(rèn)并標(biāo)定，共標(biāo)定了5 個共有峰，見圖6。

圖6 各成分HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of various constituents

2.5 樣品含有量測定

2.5.1 方法學(xué)考察

2.5.1.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.3” 項(xiàng)下貯備液，制備含5 種對照品分別為286、286、840、264、176 μg／mL 的混合對照品溶液，依次稀釋得系列質(zhì)量濃度溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.5.1.2 精密度試驗(yàn) 取山東濰坊批次供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)樣量10 μL，測得各成分峰面積RSD 均小于2.0%。表明儀器精密度良好。

2.5.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山東濰坊批次供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣，測得各成分含有量RSD 均小于1.5%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取山東濰坊批次供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得各成分含有量RSD 均小于1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的山東濰坊批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑6 份，每份約500 μL，分別精密加入相當(dāng)于500 μL 標(biāo)準(zhǔn)湯劑中5 種指標(biāo)成分含有量的對照品，用水稀釋至1 mL。加入1 mL 16%乙腈測定，計(jì)算得5 種成分的平均回收率，結(jié)果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.5.2 樣品含有量測定 取各批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，對16 批供試品溶液含有量進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了色譜柱Agilent ZORBOX?SB C18及Agilent Extend C18，選擇了分離效能最佳的Agilent Extend C18；考察了流動相不同組成及不同濃度甲酸對分離效果的影響，流動相0.2%甲酸水?乙腈分離效果較好，最終確定“2.1”項(xiàng)下色譜條件。

3.2 結(jié)果分析 16 批次山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑綠原酸含有量為0.027 9%～0.098 3%；牡荊素葡萄糖苷含有量為0.069%～0.156%；山東?3 濰坊批次的牡荊素鼠李糖苷含有量為1.793%，而山東泰安批次含有量僅為0.126%；蘆丁含有量為0.036%～0.187%；遼寧批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑金絲桃苷含有量為0.115%，山東泰安批次金絲桃苷含有量為0.001%。山楂葉道地產(chǎn)區(qū)承德的5 種黃酮類成分較穩(wěn)定；不同批次山東山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑成分有差異，可能與山楂葉采收時期不同、栽培方法等有關(guān)，后續(xù)可以對同一地區(qū)不同采收時期的山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行相應(yīng)研究。

表5 各成分含有量測定結(jié)果（%）Tab.5 Results of content determination of various constituents （%）

現(xiàn)今關(guān)于中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究多是標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備，指紋圖譜及其質(zhì)量研究。后續(xù)可以對飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的藥理活性、譜效關(guān)系等進(jìn)行相應(yīng)研究。