HPLC 法同時(shí)測(cè)定當(dāng)歸中8 種成分

鄧雪琪 管小軍 黃娜娜 李 俊

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)， 云南昆明650500； 2.云南昊辰健康有限公司， 云南昆明650500； 3.云南省民族特色養(yǎng)生理論與健康產(chǎn)品工程實(shí)驗(yàn)室， 云南昆明650500）

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.） Diels 的干燥根，主產(chǎn)于甘肅，在云南、四川、湖北等省也有種植，目前市場(chǎng)上除“岷歸”外，大多銷售的為“云當(dāng)歸”［1］。當(dāng)歸臨床應(yīng)用廣泛，具有補(bǔ)氣止血、行血、養(yǎng)血、和血之功［2］，其化學(xué)成分主要包括有機(jī)酸類、苯酞類、香豆素類等，還有一些氨基酸類［3?4］。其中阿魏酸是當(dāng)歸有機(jī)酸的主要活性成分，具有抗炎、抗老年癡呆、補(bǔ)血活血等多種功效，也是2015 年版《中國(guó)藥典》 含有量測(cè)定項(xiàng)下的規(guī)定成分［5?6］。綠原酸具有保肝、利膽、抗腫瘤、抗病毒等廣泛的藥理活性［7］。苯酞類化合物包括藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、丁烯基苯酞等，是當(dāng)歸揮發(fā)油的主要成分，其中藁本內(nèi)酯的含有量最高，該類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抑制血管生成、消炎解痛等多種藥理作用［8?11］。香豆素類化合物包括蛇床子素、補(bǔ)骨脂素、異歐前胡素、香柑內(nèi)酯、歐前胡素等［4，12］，該類化合物具有抗腫瘤、抗高血壓、抗心肌缺血、抗炎、止痛等多種藥理活性［13?14］。色氨酸是一種人體必需的氨基酸，人體自身無(wú)法合成［15］。近年來(lái)，隨著當(dāng)歸市場(chǎng)需求量的增加，由于云當(dāng)歸的優(yōu)良品質(zhì)，也逐漸成為了當(dāng)歸市場(chǎng)的重要組成部分，種植面積在不斷擴(kuò)大。為了解不同當(dāng)歸藥材的品質(zhì)，本研究建立HPLC 法檢測(cè)不同當(dāng)歸中的指標(biāo)性成分，以期為其進(jìn)行更加全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

LC?2030 高效液相色譜儀、UV?2450 紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu 公司）；1200 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；AB265?S 電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；HH?S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；Ultimate C18色譜柱（月旭材料科技有限公司）；Li?chroshper C18色譜柱（漢邦科技有限公司）。

色氨酸 （140686?201303）、綠原酸 （110753?201415）、阿魏酸 （110773?201614）、歐前胡素（110825?201616） 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ （P02F9F54165）、洋川芎內(nèi)酯H（P02F9F54165） 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；丁烯基苯酞（CHB161018） 購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司；Z?藁本內(nèi)酯（MUST?17041012） 購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈為色譜純，其余為分析純。

收集傳統(tǒng)采收期當(dāng)歸藥材共21 批，分別于云南維西、麗江、大理、瑞麗、甘肅實(shí)地采收，以及收購(gòu)于各藥材公司，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)陳紹田副教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根。信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、歐前胡素、Z?藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞對(duì)照品適量，加甲醇制備成每1 mL 含色氨酸50 μg、綠原酸70 μg、阿魏酸55 μg、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ16 μg、洋川芎內(nèi)酯H 5 μg、歐前胡素190 μg、Z?藁本內(nèi)酯500 μg、丁烯基苯酞50 μg 的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 取樣品粉末（過3 號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液過濾，取續(xù)濾液，即得。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.3 色譜條件 Ultimate C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -0.085%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～15 min，10%～12%A；15～20 min，12%～22%A；20～56 min，22%～62%A；56～60 min，62%～70%A；60～65 min，70%～10%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。結(jié)果見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密取各對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成每1 mL 含色氨酸84.40 μg、綠原酸120.40 μg、阿魏酸92.00 μg、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ25.30 μg、洋川芎內(nèi)酯H8.72 μg、歐前胡素321.60 μg、Z?藁本內(nèi)酯880.00 μg、丁烯基苯酞82.26 μg 的混合對(duì)照品貯備液，分別精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以各對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取“2.1” 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，測(cè)得色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯H、歐前胡素、Z?藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞峰面積RSD 分別為0.76%、0.43%、0.80%、1.50%、1.63%、0.62%、0.48%、2.04%。表明儀器精密度好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取當(dāng)歸藥材粉末（批號(hào)20180401），按“2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)得色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯H、歐前胡素、Z?藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞含有量RSD 分別為1.42%、1.70%、1.18%、1.84%、1.99%、1.76%、1.45%、1.92%。表明該方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下，分別于制備后0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣10 μL，測(cè)得色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯H、歐前胡素、Z?藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞峰面積RSD 分別為1.68%、1.58%、1.63%、1.75%、2.08%、1.10%、0.98%、1.76%。表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取當(dāng)歸藥材粉末（過3 號(hào)篩） 6 份，每份約0.5 g，置250 mL 錐形瓶中，加入各成分含有量已知的混合對(duì)照品貯備液2 mL，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。各成分平均回收率 97.60%～ 101.22%，RSD 0.89%～2.51%。

2.9 樣品含有量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的當(dāng)歸藥材粉末（過3 號(hào)篩） 約1.0 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定8 種成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。2.10 聚類分析 以21 批樣品中8 種有效成分含有量數(shù)值為變量，采用SPSS 19.0 軟件對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，利用歐氏距離作為樣品的測(cè)度?？v坐標(biāo)為樣品編號(hào)，結(jié)果見圖2，當(dāng)聚類標(biāo)定距離為25 時(shí)，21 批樣品聚為兩大類，樣品S1、S3 聚為第一類，其余樣品聚為第二類。當(dāng)聚類重新標(biāo)定距離為5 時(shí)，樣品S7、S9、S12 聚為第二小類，樣品S4～S6、S18、S20 聚為第三小類，樣品S2、S8～S11、S13～S17、S21 聚為第四小類。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.3 Results of content determination of various constituents （%）

圖2 21 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of twenty?one batches of samples

結(jié)合含有量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一類樣品是8 種成分總含有量最低的一批，也是Z?藁本內(nèi)酯含有量最低的一批，第二類樣品是總含有量最高的一批，也是Z?藁本內(nèi)酯和阿魏酸含有量最高的一批，而其他成分的含有量對(duì)最終的總含有量結(jié)果影響不顯著，由此可見，Z?藁本內(nèi)酯和阿魏酸含有量對(duì)當(dāng)歸藥材的質(zhì)量具有顯著影響。Z?藁本內(nèi)酯含有量高的情況下，阿魏酸以及其他的幾個(gè)苯酞類化合物洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、丁烯基苯酞的含有量一般也較高，所以，為了保證當(dāng)歸藥材的質(zhì)量，必須全面對(duì)阿魏酸和Z藁本內(nèi)酯2 種主要成分同時(shí)進(jìn)行控制，再輔以其他成分，對(duì)當(dāng)歸藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)合聚類分析和含有量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，云南維西所產(chǎn)2 批、云南瑞麗所產(chǎn)1 批當(dāng)歸為活性成分總含有量最高，表明云當(dāng)歸質(zhì)量亦佳，當(dāng)歐式距離為25 時(shí)，云南所產(chǎn)的當(dāng)歸共有18 批與甘肅當(dāng)歸聚為一類，可見，云南所產(chǎn)當(dāng)歸藥材與甘肅所產(chǎn)當(dāng)歸質(zhì)量相似。

3 討論

3.1 波長(zhǎng)選擇 對(duì)8 種成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描結(jié)果初選260、280 nm 為因素進(jìn)行考察。結(jié)果表明，相比于280 nm 波長(zhǎng)，260 nm 波長(zhǎng)下色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H 的峰面積吸收值均有不同程度的減小，而歐前胡素和丁烯基苯酞峰面積吸收值260 nm 卻比280 nm 高的多。由于綠原酸、洋川芎內(nèi)酯H 等成分含有量較低，且阿魏酸作為主要檢測(cè)指標(biāo)，在260 nm 波長(zhǎng)下峰面積吸收值減小近一半，而丁烯基苯酞和歐前胡素雖然在280 nm 波長(zhǎng)下減小較多，但是由于這2 種成分含有量較高，在280 nm 下也能被穩(wěn)定檢測(cè)，最終選用280 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取溶劑選擇 選定70% 甲醇、80% 甲醇、100%甲醇3 種溶劑，超聲和回流提取2 種方式進(jìn)行考察。結(jié)果顯示70%、80%、100%甲醇為溶劑，均能提取到阿魏酸松柏酯，甲醇比例越高，提取到的阿魏酸松柏酯含有量越高。但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，阿魏酸松柏酯含有量會(huì)逐漸減少，阿魏酸松柏酯在甲醇溶液中不穩(wěn)定，且受熱遇光也極易分解成阿魏酸和松柏酯［16?17］。所以采用70%甲醇。

4 結(jié)果與討論

本研究以當(dāng)歸中色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、歐前胡素、Z?藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞為指標(biāo)，建立HPLC 法測(cè)定其含有量，選取了云南維西、麗江、瑞麗、大理，甘肅等產(chǎn)地不同批次樣品進(jìn)行檢測(cè)，由8 種成分的含有量可知不同產(chǎn)地藥材、同一產(chǎn)地不同批次藥材有效成分含有量各不相同，如有些批號(hào)藥材就能檢測(cè)到綠原酸，有些藥材歐前胡素含有量較高，而主要的成分阿魏酸、Z?藁本內(nèi)酯含有量并無(wú)顯著性差異，表明云南出產(chǎn)的云當(dāng)歸與傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)的甘肅當(dāng)歸質(zhì)量相似。

本研究建立HPLC 法同時(shí)對(duì)當(dāng)歸中8 種成分進(jìn)行含有量測(cè)定，該方法可用于當(dāng)歸藥材質(zhì)量的全面評(píng)價(jià)。當(dāng)歸化學(xué)成分復(fù)雜，當(dāng)中包括很多熱不穩(wěn)定、見光易分解、易水解的化學(xué)成分，其中以阿魏酸松柏酯、Z?藁本內(nèi)酯為代表，作為當(dāng)歸藥材中含有量較高且有顯著藥理活性的成分，無(wú)疑是評(píng)價(jià)當(dāng)歸藥材品質(zhì)的重要指標(biāo)。阿魏酸松柏酯無(wú)論在藥材中，還是單獨(dú)作為純品，室溫條件下都極易發(fā)生水解，Z?藁本內(nèi)酯在當(dāng)歸藥材中可穩(wěn)定存在，而它的純品在室溫條件下易降解，生成多種異構(gòu)化產(chǎn)物［18］。怎樣解決對(duì)照品的純度及穩(wěn)定性，并將其穩(wěn)定用于當(dāng)歸藥材的含有量測(cè)定還有待進(jìn)一步研究。