安胰顆粒對SAP 大鼠胰腺組織NF?κB、iNOS、COX?2 表達(dá)的影響

文 玲 邊志遠(yuǎn) 廖健思 尹胡海 田玉玲 雷力民*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 廣西南寧530001； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院， 廣西南寧530011）

重癥急性胰腺炎 （severe acute pancreatitis，SAP） 是臨床內(nèi)科診療疾病中常見的需要長期治療及有著高死亡率的急危重癥，總體病死率高達(dá)20%～30%［1］。起病早期可發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征 （systemic inflammatory response syndrome，SIRS），隨后導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（multiple organ syndrome，MODS）［2］。研究表明SAP 發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞因子存在強(qiáng)相關(guān)性，細(xì)胞因子不僅參與炎癥反應(yīng)，同時可激活胰腺組織信號通路而參與胰腺微循環(huán)改變過程。核因子?κB （nuclear factor?κB，NF?κB） 作為首動因子與多種細(xì)胞因子具有上下游關(guān)系。當(dāng)NF?κB 被不適當(dāng)激活而異常增高時，一方面引起腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL） 等炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄后大量表達(dá)［3］，引發(fā)SIRS；另一方面通過一系列聯(lián)級反應(yīng)放大刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶?2（cyclo?oxygenase，COX?2） 等血管微循環(huán)相關(guān)因子快速表達(dá)而發(fā)生胰腺微循環(huán)障礙導(dǎo)致MODS 走向死亡。本研究從核因子層面出發(fā)，探討NF?κB／iNOS?COX?2 信號通路對SAP 時胰腺微循環(huán)的影響及安胰顆粒治療SAP 的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性健康SD 大鼠120 只，體質(zhì)量200～250 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［動物生產(chǎn)許可證號SCXK （桂） 2017?0002］。

1.2 藥物和試劑 安胰顆粒［4］由大承氣湯化裁，主要含有生大黃、玄明粉、甘遂、紅藤、莪術(shù)等，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)監(jiān)制，江陰天江藥業(yè)有限公司調(diào)配顆粒制劑 （批號1207303）；白介素?10 （rh IL?10，美國 PeproTech 公司）；左旋精氨酸（L?arginine，北京索萊寶科技有限公司）；EDTA（pH＝9.0） 抗原修復(fù)液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G1203）；TRIzol 試劑（美國Thermo Fisher 公司，貨號15596?026）；RNase 抑制劑（美國ABI 公司，貨號N8080119）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher 公司，貨號K1622）；PCR 檢測試劑盒（德國Qiagen 公司，貨號208054）；蘇木素染液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G1004）；HRP 標(biāo)記山羊抗大鼠IgG （武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號GB23302，稀釋比1 ∶200）；組化試劑盒DAB 顯色劑（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G1211）。

1.3 儀器 OCT 包埋劑（日本Sakura 公司）；ABI 7500 實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；脫色搖床（武漢賽維爾生物科技有限公司）；成像系統(tǒng)、正置熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為正常組、模型組、IL?10 干預(yù)組、安胰顆粒組。大鼠造模前禁食12 h，不禁水，左旋精氨酸（生理鹽水配成6%溶液） 按150 mg／100 g 給藥劑量每隔1 h 腹腔注射1 次，共3 次，誘導(dǎo)SAP 模型［5?6］。IL?10 干預(yù)組造模前1 次給予rh IL?10 10 000 U預(yù)處理后誘導(dǎo)SAP；安胰顆粒組造模前給予安胰顆粒（8 g／kg） 進(jìn)行灌胃，連續(xù)預(yù)給藥3 d后誘導(dǎo)SAP；正常組和模型組予適量生理鹽水灌胃。

2.2 樣本采集 各組于造模后3、6、12 h 時間點(diǎn)腹腔注射10% 水合氯醛（0.4 mg／g），麻醉大鼠，開腹見不同程度血性腹水，肉眼見胰腺組織水腫、出血或色蒼白壞死。摘取胰頭組織，一部分用于mRNA 提?。ù嬗谝旱?，一部分用于病理學(xué)評分及免疫組化檢查（4%中性甲醛固定）。

2.3 胰腺組織NF?κBmRNA 測定 引物由賽默飛公司設(shè)計，引物序列見表1。TRIzol 法提取樣本總RNA，取2 μg RNA 進(jìn)行去DNA 處理，采用Thermo 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再取逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA 作為模板進(jìn)行RT?PCR 檢測，反應(yīng)條件為95 ℃，2 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，共40次循環(huán)。以β?actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.4 胰腺組織病理切片 取各組的部分胰腺組織，解凍并脫水，石蠟包埋成功后切為多個5 μm 樣本切片，經(jīng)展片及烤片后脫蠟并分別進(jìn)行蘇木素及伊紅染液染色，沖洗、脫水、脫蠟、風(fēng)干封片后在光學(xué)顯微鏡下取10 個視野攝片保存。經(jīng)病理學(xué)評分后顯示造模成功。

2.5 胰腺組織iNOS、COX?2 測定 取4%中性甲醛固定的樣本，切取所需部位組織塊按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋及切片，展片、撈片、控片、烤片處理后對組織切片進(jìn)行浸泡、修復(fù)、孵育、DAB 顯色、蘇木素染色、脫水等處理后封片保存，拍照，采用免疫組化累積光密度值（IOD） 分析方法（每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選至少3 個200 倍視野進(jìn)行拍照），將相同的黃棕色判讀為陽性作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，用Image?Pro Plus 6.0 進(jìn)行分析，計算每張照片陽性的累積光密度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（） 表示。正態(tài)分布且方差齊時，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法；不滿足正態(tài)分布或方差不齊時，采用Kruskal?Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)并作組間多重比較。按α ＝0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 胰腺組織損傷及病理學(xué)觀察 正常組見正常白色胰腺組織，無明顯腹水，病理標(biāo)本見完整胰腺小葉及腺泡結(jié)構(gòu)。模型組開腹見大量深紅色血性腹水，腹水量隨時間增加而增加，胰腺組織模糊不清呈暗紅色，伴滲血或壞死；病理下見胰腺小葉、腺泡、細(xì)胞間隙增寬，胰腺小葉結(jié)構(gòu)改變，大量炎癥細(xì)胞浸潤，腺泡腫脹、空泡化、壞死，且發(fā)生時間早。IL?10 干預(yù)組及安胰顆粒組開腹見紅色血性腹水，腹水量較模型組少，胰腺組織水腫呈蒼白色或見點(diǎn)狀出血，胰腺邊界模糊；病理下見胰腺小葉輕度水腫、間隙增寬、灶性或點(diǎn)狀壞死，其水腫、變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤程度較模型組減輕。各組病理切片見圖1。

圖1 造模后6 h 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)（HE，×200）Fig.1 Image of pancreatic histopathology of each group six hours after modeling （HE，×200）

3.2 胰腺組織NF?κBmRNA 表達(dá)檢測 左旋精氨酸誘導(dǎo)SAP 模型3、6、12 h 后，模型組胰腺組織NF?κBmRNA 表達(dá)均升高（P＜0.01）；經(jīng)IL?10 及安胰顆粒干預(yù)后，NF?κBmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；IL?10 干預(yù)組及安胰顆粒組各時間點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。尚不能認(rèn)為安胰顆粒組抑制NF?κBmRNA 表達(dá)能力較IL?10 干預(yù)組佳。

表2 安胰顆粒對胰腺組織NF?κB mRNA 表達(dá)的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Anyi Granules on pancreatic expression of NF?κB mRNA（，n＝10）

表2 安胰顆粒對胰腺組織NF?κB mRNA 表達(dá)的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Anyi Granules on pancreatic expression of NF?κB mRNA（，n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

3.3 胰腺組織iNOS 的表達(dá)檢測 左旋精氨酸誘導(dǎo)SAP 模型3、6、12 h 后，模型組大鼠胰腺組織iNOS 表達(dá)升高（P＜0.01）；經(jīng)IL?10 及安胰顆粒干預(yù)后，iNOS 表達(dá)降低（P＜0.01）；IL?10 干預(yù)組及安胰顆粒組各時間點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。尚不能認(rèn)為安胰顆粒組抑制iNOS 的表達(dá)能力較IL?10 干預(yù)組佳。各組胰腺組織iNOS 第12 小時的免疫組化見圖2。

表3 安胰顆粒對胰腺組織iNOS 表達(dá)的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Anyi Granules on pancreatic iNOS expression （， n＝10）

表3 安胰顆粒對胰腺組織iNOS 表達(dá)的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Anyi Granules on pancreatic iNOS expression （， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

圖2 免疫組化檢測造模后12 h 各組胰腺組織iNOS、COX?2 表達(dá)（×200）Fig.2 Detection of pancreatic iNOS and COX?2 expression of each group twelve hours after modeling by immunohistochemical （×200）

3.4 胰腺組織COX?2 的表達(dá)檢測 左旋精氨酸誘導(dǎo)SAP 模型3、6、12 h 后，模型組胰腺組織COX?2表達(dá)升高（P＜0.01），且12 h 達(dá)到高峰；經(jīng)IL?10 及安胰顆粒干預(yù)后，COX?2 表達(dá)降低（P＜0.01）；IL?10 干預(yù)組及安胰顆粒組各時間點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。尚不能認(rèn)為安胰顆粒組抑制COX?2 的表達(dá)能力較IL?10 干預(yù)組佳。各組胰腺組織COX?2 第12 小時的免疫組化見圖2。

表4 安胰顆粒對胰腺組織COX?2 表達(dá)的影響（， n＝10）Tab.4 Effects of Anyi Granules on pancreatic COX?2 expression （， n＝10）

表4 安胰顆粒對胰腺組織COX?2 表達(dá)的影響（， n＝10）Tab.4 Effects of Anyi Granules on pancreatic COX?2 expression （， n＝10）

注：與正常組比，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

4 討論

炎性浸潤及微循環(huán)障礙同時影響SAP 進(jìn)程及預(yù)后，眾多研究已表明炎癥因子參與SAP 的發(fā)生，但從微循環(huán)角度研究尚有不足，本實(shí)驗(yàn)從NF?κB對其下游因子iNOS、COX?2 影響的角度闡明SAP時發(fā)生微循環(huán)障礙的可能機(jī)制。NF?κB［7?9］是人體中普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子，通常存在于細(xì)胞質(zhì)且無活性，SAP 時NF?κB 受到刺激后迅速激活并移至細(xì)胞核中，易位過程中介導(dǎo)眾多炎癥基因的表達(dá)，進(jìn)一步激活促炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子及包括iNOS、COX?2 在內(nèi)的誘導(dǎo)酶等，而這些因子或酶的表達(dá)又進(jìn)一步激活更多的NF?κB，如此循環(huán)往復(fù)，炎癥反應(yīng)及微循環(huán)障礙持續(xù)加重。本實(shí)驗(yàn)中，模型組造模后3 h NF?κB 表達(dá)明顯升高，12 h達(dá)到本實(shí)驗(yàn)觀察的峰值，表明NF?κB 在SAP 開始的12 h 內(nèi)呈遞增趨勢。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS） 廣泛存于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板和胰腺中，在分子水平上調(diào)控NO 合成。其分為3 種亞型［10］，其中神經(jīng)型和內(nèi)皮型在細(xì)胞及組織中持續(xù)存在但只生成極少量的NO；誘導(dǎo)型只有在如NF?κB 的下游因子（腫瘤壞死因子、白介素1、干擾素?α 等） 刺激下才生成，誘導(dǎo)型NOS的生成能刺激產(chǎn)生大量的NO。NO 是一種參與微循環(huán)和炎癥反應(yīng)的高活性自由基，在機(jī)體中不僅是一種信號分子也是內(nèi)毒素或促炎細(xì)胞因子，與SAP的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［3］。SAP 過程中，iNOS 生成增加引起NO 過度表達(dá)，造成胰腺微血管難治性擴(kuò)張，血流瘀滯，胰腺微循環(huán)缺血，同時引起的胰腺缺血?再灌注損傷過程中生產(chǎn)大量氧自由基，直接損害包括胰管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的胰腺微循環(huán)血管系統(tǒng)，引起嚴(yán)重的微循環(huán)障礙［11?13］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組iNOS 的表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)iNOS 與SAP 的密切關(guān)系。COX?2 是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列環(huán)素、血栓素和前列腺素等生理活性類花生酸的限速酶，在機(jī)體正常情況下在組織中不可測或表達(dá)極少，只有炎癥發(fā)生時才會表達(dá)，因此其異常表達(dá)與炎癥輕重程度密切相關(guān)［14］。SAP 過程中，NF?κB 可誘導(dǎo)COX?2 生成，COX?2 的代謝產(chǎn)物中前列腺素E2 （prostaglandin，PGE2） 在炎癥、胰島破壞和抑制胰島素分泌中起著關(guān)鍵作用［15?16］。COX?2亦可刺激NO 生成增多，協(xié)同前列腺素直接影響胰島細(xì)胞增殖、分化和血管生成，加快胰島細(xì)胞凋亡而使胰腺微循環(huán)障礙進(jìn)一步加重［17?18］。NO 還可增強(qiáng)COX?2 的活性，二者在相關(guān)研究的免疫反應(yīng)性評分中表現(xiàn)出顯著相關(guān)性［18］，在SAP 中協(xié)同發(fā)揮作用，共同參與并加重胰腺微循環(huán)障礙。

安胰顆粒是以大承氣湯加減理氣止痛、清熱解毒、活血祛瘀等藥而成。SAP 早期即可出現(xiàn)微循環(huán)障礙，而輕癥胰腺炎中并不明顯，因此安胰顆粒特別選擇了甘遂、紅藤、莪術(shù)三藥，輕癥胰腺炎則不用，是安胰顆粒臨床應(yīng)用加減使用的特點(diǎn)。而紅藤、莪術(shù)用于重癥急性胰腺炎的文獻(xiàn)鮮見，紅藤功效清熱解毒、活血止痛、治腸癰腹痛要藥，莪術(shù)破血祛瘀、行氣止痛，二藥主要針對重癥胰腺炎熱毒血瘀互結(jié)的病理本質(zhì)所用。方中紅藤通過調(diào)節(jié)NF?κB信號通路，抑制細(xì)胞因子TNF?α、IL?1β、IL?10 的分泌，下調(diào)血栓素2 水平及血栓素2 與前列環(huán)素2 的比值等來抑制或延緩炎癥反應(yīng)及損害，改善血管通透性以達(dá)到有效的抗炎抗凝作用［19?22］。莪術(shù)可有效降低NF?κB 的表達(dá)來減少血管內(nèi)皮因子（如NO） 的表達(dá)，NO 生成的減少既能緩解血液粘稠易凝狀態(tài)，還能較好的抑制COX?2，以減少其下游的PGE2介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)，達(dá)到緩解SAP 病情的目的［23?27］。安胰顆粒的配伍特點(diǎn)對于SAP 不僅清熱通腑、理氣止痛，更有活血祛瘀之功，為其能有效治療SAP 提供進(jìn)一步的可靠證據(jù)。在本實(shí)驗(yàn)中，由左旋精氨酸誘導(dǎo)的SAP 在經(jīng)過安胰顆粒灌胃預(yù)處理3 d 后，水腫、炎性浸潤、細(xì)胞損傷及胰腺出血壞死較模型組明顯減輕，胰腺組織中NF?κB、iNOS、COX?2 表達(dá)也明顯下降，表明安胰顆?？赡芡ㄟ^抑制三者的表達(dá)以減輕SAP 時的炎癥反應(yīng)及微循環(huán)障礙程度。

本實(shí)驗(yàn)表明，SAP 發(fā)生時核因子?κB 大量表達(dá)，iNOS、COX?2 表達(dá)也顯著增加，安胰顆粒能顯著降低SAP 大鼠胰腺組織NF?κB、iNOS、COX?2表達(dá)，通過階梯性降低細(xì)胞因子的表達(dá)而改善胰腺微循環(huán)障礙的嚴(yán)重程度從而達(dá)到治療SAP 的目的。