熟地黃對(duì)ADHD 模型大鼠前額葉皮質(zhì)線粒體的保護(hù)作用

袁海霞 倪新強(qiáng) 韓新民 鄭 敏 陳天翼 喻閩鳳 宋宇塵

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所， 江蘇南京210023； 2.深圳市中醫(yī)院， 廣東深圳518038）

注意缺陷多動(dòng)障礙 （attention deficit hyperactivity disorder，ADHD） 是兒童時(shí)期常見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，我國的發(fā)病率約為6.29%［1］，其核心癥狀為注意缺陷、多動(dòng)和沖動(dòng)，常與焦慮、品行障礙、對(duì)立違抗障礙、學(xué)習(xí)困難等共存，并與自殺和犯罪活動(dòng)關(guān)系緊密，嚴(yán)重影響患兒健康成長［2?3］。ADHD 是一種病因復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未被完全揭示。越來越多的研究表明線粒體功能紊亂與ADHD 發(fā)病有密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)與能量代謝相關(guān)的線粒體DNA 10398A／G的多態(tài)性引起的線粒體功能障礙可能是ADHD 的重要遺傳病因［4］。有病例報(bào)道，ADHD 兒童的線粒體DNA 存在點(diǎn)突變，另有一名在青春期患ADHD的中年女性存在線粒體DNA 序列的重新排列［5］。有學(xué)者利用線粒體DNA 缺失細(xì)胞（ρ0 細(xì)胞） 分別與ADHD 患兒和正常兒童的血小板進(jìn)行細(xì)胞融合構(gòu)建胞質(zhì)雜交細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常兒童相比，ADHD 胞質(zhì)雜交細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的線粒體功能缺陷，表現(xiàn)為線粒體膜電位低下、氧化應(yīng)激升高等［6］。

另外，有影像學(xué)研究表明，ADHD 患兒大腦皮質(zhì)（尤其是前額葉皮質(zhì)） 存在明顯的成熟延遲，表現(xiàn)為皮質(zhì)達(dá)到50%峰厚度的平均年齡比正常兒童晚3 歲［7］。前額葉皮質(zhì)是調(diào)控自發(fā)性活動(dòng)、注意力、學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力的重要腦區(qū)，神經(jīng)元發(fā)育障礙在其成熟延遲的機(jī)制中扮演不可或缺的角色，而線粒體功能障礙至關(guān)重要地參與了神經(jīng)元發(fā)育障礙的病理過程［8］。綜上所述，深入探索線粒體功能紊亂在ADHD 病因病機(jī)中扮演的角色以及尋求靶向保護(hù)線粒體功能的治療手段具有重要意義。鑒此，本實(shí)驗(yàn)以幼齡自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR） 為兒童ADHD 模型，針對(duì)熟地黃調(diào)控其前額葉皮質(zhì)線粒體功能的作用及相應(yīng)機(jī)制展開研究。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SHR 大鼠30 只，Wistar?Kyoto（WKY） 大鼠10 只，均為雄性，3 周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2016?0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于12 h光照／12 h 黑暗逆轉(zhuǎn)交替（人工光照，9： 00 關(guān)燈，21： 00 開燈）、室溫20～22 ℃、相對(duì)濕度45%～55%的動(dòng)物房中，自由進(jìn)食及飲水。

1.2 藥物 熟地黃Rehmannia glutinosa（Gaetn.）Libosch.ex Fisch.et Mey.購于北京同仁堂藥店（批號(hào)151001，產(chǎn)地河南），由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室主任巢建國教授鑒定為正品。稱取熟地黃適量，第1 次加入10 倍量蒸餾水，浸泡0.5 h，武火煎沸后改用文火煎45 min；第2～3 次分別加8 倍量水煎30 min；每次均用8 層紗布過濾，合并3 次藥液，真空冷凍干燥，得熟地黃水提物。鹽酸哌甲酯緩釋片 （Methylphenidate，MPH，國藥準(zhǔn)字J20151103） 為陽性對(duì)照藥，購自西安楊森制藥有限公司。全部藥物均用0.5% CMC?Na 配置成混懸液，超聲溶解，4 ℃保存。

1.3 儀器 UC7 超薄切片機(jī)（德國Leica 公司）；HT7700 透射式電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀（美國Becton?Dickinson公司）；BS?420 全自動(dòng)生化儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

1.4 試劑 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛混合固定液（貨號(hào) JRS0278）、4% 戊二醛固定液 （貨號(hào)JRS0293），4%多聚甲醛固定液（貨號(hào)JRS0271）、丙酮（貨號(hào)E646）、鋨酸（貨號(hào)r022953） 均購自南京金益柏生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)10569010） 購自美國Gibco 公司；胎牛血清（貨號(hào)FCS500） 購自上海依科賽生物制品有限公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)KGA604）、活性氧檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)KGT010?1） 購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；超氧化物歧化酶測(cè)試盒（貨號(hào)HY?60001）、過氧化氫酶試劑盒（貨號(hào)HY?60015） 購自北京華英生物技術(shù)研究所；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)C1098） 購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 分組和給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將SHR 大鼠分為3 組，每組10 只，分別為模型組、MPH 組 （2 mg／kg）、熟地黃組（2.4 g／kg），WKY 大鼠為正常組。熟地黃給藥劑量為生藥劑量，前期數(shù)據(jù)挖掘顯示熟地黃10 g 為臨床治療兒童ADHD 使用頻次最多的單日劑量，參照《中藥藥理研究方法學(xué)》［9］方法進(jìn)行大鼠與人臨床用藥劑量之間的換算，并結(jié)合參考文獻(xiàn)研究［10］進(jìn)行優(yōu)化，最終得出熟地黃給藥劑量為2.4 g／kg。正常組和模型組均以0.5% CMC?Na 溶液灌胃，給藥體積為2 mL／kg。每日稱定大鼠體質(zhì)量及攝食量后，于9： 30～10： 30、15： 30～16： 30分2 次灌胃，連續(xù)干預(yù)4 周。

2.2 透射電鏡觀察前額葉皮質(zhì)線粒體超微結(jié)構(gòu) 各組大鼠先做麻醉處理，以2%多聚甲醛-2.5%戊二醛混合液進(jìn)行慢速灌流，迅速取出全腦，切取前額葉皮質(zhì)（不超過1 mm×1 mm×1 mm），置于4%戊二醛溶液4 ℃固定2～4 h；0.1 mol／L 磷酸緩沖液（PBS） 漂洗，1%鋨酸-0.1 mol／L PBS 室溫下進(jìn)行后固定2 h；后經(jīng)漂洗，酒精?丙酮梯度脫水，浸透，包埋聚合、切片（60～80 nm）、鈾鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2.3 JC?1 染色法檢測(cè)MMP 各組大鼠麻醉后分離前額葉皮質(zhì)，胰酶消化1 h，DMEM 培養(yǎng)基終止消化，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106／mL，按照試劑盒說明書配制孵育緩沖液和JC?1 工作液，取500 μL JC?1 工作懸浮細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃孵育20 min；2 000 r／min 室溫離心5 min，收集細(xì)胞，孵育緩沖液清洗2 次，重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)綠色熒光百分比。

2.4 DCFH?DA 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平 標(biāo)本采集及調(diào)整細(xì)胞濃度同“2.3” 項(xiàng)下，按照試劑盒說明書用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH?DA（1 ∶1 000），用稀釋后的DCFH?DA 懸浮細(xì)胞，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每5 min 顛倒混勻1 次，使探針和細(xì)胞充分接觸；無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。

2.5 比色法檢測(cè)SOD、CAT 水平 各組大鼠麻醉后分離出前額葉皮質(zhì)，取10 mg 組織分別存放于4 ℃預(yù)冷的緩沖液中，采用低溫研磨儀制備組織勻漿，10 000g離心5 min，取上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)前額葉皮質(zhì)中SOD、CAT水平。

2.6 TUNEL 染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 各組大鼠麻醉后用4% 多聚甲醛固定液進(jìn)行灌注，經(jīng)固定、脫水、透明、包埋切片、脫蠟、水化后按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行染色處理，中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（） 表示。多組間比較方差齊則采用單因素方差分析，方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 熟地黃對(duì)SHR 大鼠進(jìn)食量的影響 如表1 所示，藥物干預(yù)第2 周時(shí)，與模型組比較，熟地黃組的進(jìn)食量下降（P＜0.01）；第4 周時(shí)，MPH 組進(jìn)食量與模型組比有下降趨勢(shì)（P＜0.05），而熟地黃組與MPH 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠每周平均進(jìn)食量（g，， n＝10）Tab.1 Average weekly food intake of rats in each group （g，， n＝10）

表1 各組大鼠每周平均進(jìn)食量（g，， n＝10）Tab.1 Average weekly food intake of rats in each group （g，， n＝10）

注：與同時(shí)間模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 熟地黃對(duì)SHR 大鼠體質(zhì)量的影響 如表2 所示，與同時(shí)間模型組相比，MPH 組和熟地黃組大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠每周平均體質(zhì)量（g，， n＝10）Tab.2 Average weekly body weight of rats in each group （g，， n＝10）

表2 各組大鼠每周平均體質(zhì)量（g，， n＝10）Tab.2 Average weekly body weight of rats in each group （g，， n＝10）

3.3 熟地黃對(duì)SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖1 所示，相較于正常組，模型組前額葉皮質(zhì)線粒體出現(xiàn)腫脹擴(kuò)張，線粒體嵴斷裂消失嚴(yán)重，有的線粒體出現(xiàn)固縮，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰，其神經(jīng)元核膜也呈現(xiàn)出邊界模糊，有斷裂。與模型組比較，MPH 組線粒體仍有腫脹擴(kuò)張，線粒體嵴消失較多，仍可見多處的神經(jīng)元核膜斷裂；熟地黃組線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，可見線粒體嵴，未見明顯腫脹的線粒體，其神經(jīng)元核膜雖有斷裂，但內(nèi)外膜有相對(duì)清晰的邊界。

圖1 各組大鼠前額葉皮質(zhì)線粒體超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of prefrontal cortex mito?chondria of rats in each group

3.4 熟地黃對(duì)SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)MMP 的影響 MMP較高時(shí)，JC?1 形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光；MMP 較低時(shí)，JC?1 為單體產(chǎn)生綠色熒光，因此綠色熒光水平與MMP 呈負(fù)相關(guān)。如圖2 所示，與正常組比較，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)MMP 降低（P＜0.01）；與模型組比較，MPH 組MMP 下降（P＜0.01）；熟地黃組MMP 則升高（P＜0.01）。

3.5 熟地黃對(duì)SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響 如圖3 所示，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平高于正常組（P＜0.01）；與模型組比較，MPH 組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高（P＜0.01），而熟地黃組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平則降低（P＜0.01）。

3.6 熟地黃對(duì)SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)SOD、CAT 水平的影響 如圖4 所示，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)SOD、CAT 水平低于正常組（P＜0.01）；與模型組比較，MPH 組SOD 水平下降（P＜0.05），熟地黃組SOD、CAT 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 各組大鼠前額葉皮質(zhì)MMP （n＝3）Fig.2 Prefrontal cortex MMP of rats in each group（n＝3）

圖3 各組大鼠前額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平（n＝3）Fig.3 Prefrontal cortex ROS level of rats in each group（n＝3）

3.7 熟地黃對(duì)SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響 如圖5 所示，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡水平高于正常組（P＜0.01）；與模型組比較，MPH 組神經(jīng)元凋亡增加（P＜0.05），而熟地黃組神經(jīng)元凋亡降低（P＜0.01）。

4 討論

經(jīng)典的益腎填髓中藥熟地黃是目前公開發(fā)表治療ADHD 的有效復(fù)方中使用頻次最多的藥物［11］；另外，絕大多數(shù)以補(bǔ)腎填精為主要治法的復(fù)方均將熟地黃列為君藥［12?14］，可見熟地黃是治療ADHD的核心中藥。本課題組已基于“腎腦相關(guān)” 以及“皮質(zhì)成熟延遲” 理論提出了“熟地黃可能通過改善神經(jīng)元發(fā)育障礙控制ADHD 核心癥狀” 的假設(shè)［15］。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，熟地黃可以顯著減少兒童ADHD 動(dòng)物模型幼齡SHR 大鼠的多動(dòng)、沖動(dòng)行為，并能提高其空間學(xué)習(xí)記憶能力［16］。本研究是對(duì)假設(shè)和前期實(shí)驗(yàn)的延展性探索，試圖從線粒體功能的角度闡釋熟地黃改善ADHD 癥狀的潛在機(jī)理。

圖4 各組大鼠前額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT 水平（n＝3）Fig.4 SOD and CAT levels in prefrontal cortex of rats in each group （n＝3）

圖5 各組大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡（n＝3）Fig.5 Neuronal apoptosis in prefrontal cortex of rats in each group （n＝3）

有研究表明，以MPH 為代表的精神興奮劑雖能有效緩解ADHD 的核心癥狀，但長期服用此類藥物可產(chǎn)生食欲減退、生長抑制等不良反應(yīng)，會(huì)造成較低的體質(zhì)量指數(shù)［17?18］。本研究發(fā)現(xiàn)，前3 周的MPH 干預(yù)對(duì)SHR 大鼠的進(jìn)食量無明顯影響；在第4 周時(shí)MPH 組進(jìn)食量出現(xiàn)顯著減少。第2 周時(shí)，熟地黃會(huì)降低SHR 大鼠的進(jìn)食量，第3～4 周則對(duì)其進(jìn)食量無明顯改變。由此可見，熟地黃短期干預(yù)會(huì)影響SHR 大鼠進(jìn)食量，這可能是由于中藥特殊氣味、口感或黏度影響其食欲造成，當(dāng)長期服用適應(yīng)后，進(jìn)食量則不受影響。相比熟地黃，MPH 干預(yù)對(duì)SHR 大鼠食欲的不良影響在第4 周時(shí)才逐漸顯現(xiàn)。二者對(duì)SHR 大鼠體質(zhì)量未見明顯影響。ADHD 是慢性精神發(fā)育障礙性疾病，其漫長的治療期使得長期藥物干預(yù)引發(fā)的不良反應(yīng)更值得關(guān)注，從這一角度出發(fā)，熟地黃似乎比MPH 表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)。但因本實(shí)驗(yàn)未能評(píng)估藥物對(duì)其體質(zhì)量指數(shù)的影響；另外，未對(duì)停藥后各組大鼠的進(jìn)食量和體質(zhì)量進(jìn)行持續(xù)觀測(cè)，因此，尚不足以得出相關(guān)確切的結(jié)論。

線粒體是細(xì)胞能量產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，完整的結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，與WKY大鼠相比，SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)存在線粒體功能缺陷，其ATP 合成率降低了30%，這為ADHD 可能是一種“能量缺陷” 疾病提供了依據(jù)［19］。有學(xué)者采用透射電鏡比較了WKY 和SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)線粒體的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SHR 大鼠線粒體嵴和膜融合模糊不清，提示其線粒體結(jié)構(gòu)存在異常［20］。與此結(jié)果相近，本研究發(fā)現(xiàn)SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)線粒體數(shù)量相對(duì)減少，有的線粒體腫脹擴(kuò)張，嵴消失嚴(yán)重，呈現(xiàn)空泡化，有的線粒體出現(xiàn)固縮以致內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰；除此，其神經(jīng)元核膜亦有多處斷裂，邊界模糊不清。由此可以推測(cè)，SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)存在的線粒體數(shù)量減少和結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的功能缺陷極可能是其ATP 合成率降低從而引起能量缺乏的重要原因，亦或引發(fā)了神經(jīng)元核膜結(jié)構(gòu)的異常。這一結(jié)果從動(dòng)物模型層面提示線粒體功能缺陷介導(dǎo)的神經(jīng)元發(fā)育障礙可能參與了ADHD 的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)過4 周的干預(yù)，MPH 未能緩解SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元核膜和線粒體的上述異常；熟地黃則減輕了其線粒體的腫脹，減少了嵴的消失，使之內(nèi)部結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰。這從超微結(jié)構(gòu)層次提示熟地黃對(duì)線粒體及神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用。

MMP 是反應(yīng)線粒體功能的重要指標(biāo)。MMP 降低會(huì)引起線粒體細(xì)胞色素C 的釋放，進(jìn)而觸發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因此是細(xì)胞凋亡的早期特征。本研究發(fā)現(xiàn)，與WKY 大鼠比較，SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)MMP 顯著降低，結(jié)合透射電鏡結(jié)果，提示SHR 大鼠線粒體存在由結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的功能損傷。4 周的干預(yù)后，MPH 降低而熟地黃則提高了MMP 水平，提示熟地黃具有保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的雙重作用。線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生的ROS 參與重要的生理活動(dòng)，比如細(xì)胞生長和分化。然而，過度的生成以及失去抗氧化酶系統(tǒng)如SOD 和CAT 平衡的ROS 增多會(huì)直接導(dǎo)致線粒體DNA 損傷［21］。研究表明，SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)呈現(xiàn)出另一種抗氧化酶—谷胱甘肽過氧化物酶的活性降低，以及缺乏有效抗氧化平衡的ROS 的增加［22］。本研究結(jié)果與之相似，發(fā)現(xiàn)與WKY 大鼠相比，SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS 明顯增加，而SOD 和CAT 的活性則顯著降低，說明SHR 大鼠腦部存在與其行為特征相關(guān)的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MPH治療可能誘發(fā)SHR 多個(gè)腦區(qū)的脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)羰基化增加，以及抗氧化酶的活性降低［23］。本研究中，MPH 的干預(yù)不僅增加SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)ROS 的水平，同時(shí)降低SOD 活性，說明MPH暴露會(huì)加重SHR 大鼠線粒體的氧化損傷，這與前人的研究結(jié)論相似［24］。與MPH 相反，熟地黃的治療則可通過減少SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，提高SOD 和CAT 的活性維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，緩解線粒體氧化損傷，這可能是其發(fā)揮線粒體保護(hù)作用，進(jìn)而改善SHR 大鼠ADHD 樣行為特征的機(jī)制之一。

如前所述，線粒體不僅是能量代謝的場(chǎng)所，并且參與了內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。而能量代謝障礙與神經(jīng)元凋亡已被證實(shí)與ADHD 的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系［25?26］，本研究已初步表明熟地黃可抑制SHR 大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡。那么，熟地黃是否能夠調(diào)控能量代謝以及抑制神經(jīng)元凋亡的相關(guān)機(jī)制仍值得縱深研究。