景虎通脈方抗ApoE?／?小鼠動脈粥樣硬化的作用機制研究

麻 莉 楊迎飛 黃 豐 和鳳軍 周 敏 王明明 朱智蕓 胡旭紅 童曉云*

（1.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院， 云南昆明650021； 2.昭通市中醫(yī)院， 云南昭通657000； 3.云南中醫(yī)藥大學中藥學院， 云南昆明650500； 4.寧鄉(xiāng)市中醫(yī)醫(yī)院， 湖南寧鄉(xiāng)410600）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS） 與多種心腦血管病變相關，其病理變化與多種因素相關，其中，免疫炎癥反應扮演了重要角色［1］。研究表明，免疫炎癥反應參與AS 斑塊形成的起始環(huán)節(jié)，也是斑塊不穩(wěn)定的重要因素［2］。景虎通脈方為云南省榮譽名中醫(yī)、云南省心腦血管病專家趙淳教授的臨床驗方，臨床實踐表明其有較好抗動脈粥樣硬化的作用。課題組前期實驗表明，景虎通脈方能有效降低高脂血癥模型兔的頸動脈斑塊形成，降低血總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG） 及低密度脂蛋白（LDL?C） 水平，并能降低外周血的炎癥因子，如細胞間黏附分子?1 （Intercellular Cell Adhesion Molecule?1，ICAM?1）、IL?6 的表達，該作用可能與其抑制Toll 樣受體4 （Toll?like receptor 4，TLR4） 信號通路密切相關［3?4］。大量研究表明TLR4 通路異常激活在AS 免疫炎癥中發(fā)揮重要作用，因此，干預TLR4 通路的異常激活，可能對防治AS 有重要意義。近年的研究提示核受體77（Nuclear Receptor Nur77） 基因缺失斑塊內(nèi)的TLR4基因表達會增高，促進AS 形成［5］。為探尋景虎通脈方是否通過調(diào)控Nur77 蛋白抑制TLR4 信號通路，本研究擬利用高脂飼料飼養(yǎng)ApoE-／-小鼠，通過多種指標觀察景虎通脈方作用機制。同時，為進一步深入研究景虎通脈方的作用機制，本實驗還采用miRNA 基因芯片分析景虎通脈方可能的作用途徑，觀察其與TLR4 及Nur77 信號通路的其他分子是否有關系。

1 材料

1.1 動物 SPF 級C57BL／6／J 小鼠6 只（作為正常組），ApoE-／-小鼠30 只（分5 組），體質(zhì)量（25±5） g，雄性，購于維通利華實驗有限公司 （北京），生產(chǎn)許可證號SCXK （京） 2012?0001。

1.2 藥物與試劑 景虎通脈方組成為紅景天10 g（河北金葉子藥業(yè)有限公司，批號171101C180）、虎杖20 g、三七10 g、茯苓15 g （云南省中醫(yī)醫(yī)藥中藥房）、菲牛蛭凍干粉1 g （云南海瑞迪生物公司，批號201309199）、隔山消15 g （安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司，批號1604001），經(jīng)云南省中醫(yī)醫(yī)藥藥學部李松梅主任鑒定為正品，制成浸膏，于4 ℃保存?zhèn)溆?。阿托伐他汀（立普妥，輝瑞制藥有限公司，批號H20051407）。TG 試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號177761）；TC 試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號177601）；LDL?C 試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號170701）；高密度脂蛋白（HDL?C） 試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號170651）；腫瘤壞死因子α （TNF?α） 試劑盒（杭州聯(lián)科生物科技有限公司，批號220680726）；白介素?1β （IL?1β） 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術有限公司，批號2201870231）；白介素?6 （IL?6）試劑盒 （杭州聯(lián)科生物技術有限公司，批號220680124）。Luminex 試劑盒 （美國R＆D 公司，批號L123808）。

1.3 儀器 HERAEUS MEGAFUGE 臺式離心機（美國Thermo 公司）；Spectra Max i3x 酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；Dm 2500 圖像分析系統(tǒng)（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 雄性C57BL／6／J 小鼠6只為正常組，予普通飼料。6 周齡ApoE-／-小鼠共30 只，適應性飼養(yǎng)1 周，予高脂膳食飼料（含脂肪21%，膽固醇0.15%） 繼續(xù)喂養(yǎng)8 周，以建立AS 模型。隨機分為模型組、陽性對照組（阿托伐他汀10 mg／kg） 及景虎通脈方高、中、低劑量組（18.20、9.10、4.55 g／kg），每組各6 只，然后開始藥物干預，灌胃給藥，1 次／d，8 周后處死動物取材。

2.2 檢測指標

2.2.1 血脂4 項 取小鼠外周血，3 000 r／min 離心10 min，取血清，按照試劑盒說明書測定血脂TC、TG、HDL?C 及LDL?C 水平。

2.2.2 HE 染色 取小鼠主動脈根部制成常規(guī)石蠟切片，HE 染色，觀察、拍照并采用Image?pro?plus 5.0 圖像處理軟件計算斑塊面積。

2.2.3 Masson 染色 取小鼠主動脈根部制成常規(guī)石蠟切片，經(jīng)Masson 染色，觀察后拍照并采用IPP 5.0 圖像處理軟件計算斑塊內(nèi)膠原比例；AS 斑塊面積＝ ［（斑塊面積／血管腔總面積）］ ×100%。

2.2.4 炎性因子TNF?α、IL?1β、IL?6 檢測 根據(jù)ELISA 試劑盒說明書對小鼠血清進行測定。

2.2.5 免疫組化檢測TLR4、Nur77 表達 免疫組化檢測主動脈根部中TLR4、Nur77 表達，觀察后拍照。陽性表達為胞質(zhì)或胞膜呈棕褐色顆粒。采用Image?Pro?Plus、IPP 6.0 圖像處理軟件計算陽性面積。

2.2.6 Western blot 檢測TLR4、Nur77 表達 取適量新鮮血管，提取總蛋白，用Western blot 法分別檢測TLR4、Nur77 表達，采用Image?Pro?Plus，IPP 6.0 圖像處理軟件進行定量。

2.2.7 基因芯片雜交技術篩選差異基因 取適量新鮮主動脈，提取總RNA，與miRNA 芯片進行雜交得到數(shù)據(jù)進行分析。

2.3 統(tǒng)計學方法 多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間的比較采用t檢驗，研究中的計量資料采用 （） 表示。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 血脂檢測 與正常組小鼠比較，模型組小鼠外周血中TC、TG、LDL?C、HDL?C 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組及景虎通脈方各劑量組TC、TG、LDL?C 水平均有不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），景虎通脈方各劑量組HDL?C 水平不同程度升高 （P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 各組小鼠血脂水平（， n＝6）Tab.1 Serum lipid levels of mice in each group （， n＝6）

表1 各組小鼠血脂水平（， n＝6）Tab.1 Serum lipid levels of mice in each group （， n＝6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 HE 染色 正常組小鼠的血管內(nèi)膜比較完整，未見AS 斑塊；模型組小鼠的血管內(nèi)見到較多斑塊，血管壁厚度呈不均勻狀態(tài)（圖1）；相比于模型組，陽性對照組及景虎通脈方組小鼠主動脈血管內(nèi)斑塊面積減?。≒＜0.01），見表2。

圖1 小鼠HE 染色在各組中的變化Fig.1 Changes of HE staining in mice of each group

表2 各組小鼠AS 斑塊面積（， n＝6）Tab.2 AS plaque areas in mice of each group （，n＝6）

表2 各組小鼠AS 斑塊面積（， n＝6）Tab.2 AS plaque areas in mice of each group （，n＝6）

注：與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.3 Masson 染色 正常組小鼠的主動脈內(nèi)未見斑塊，且無斑塊內(nèi)膠原纖維；相比于模型組，陽性對照組及景虎通脈方高、中、低劑量組小鼠的主動脈斑塊內(nèi)可見膠原纖維增加（P＜0.01），見圖2、表3。

3.4 ELISA 檢測炎性因子TNF?α、IL?1β、IL?6 水平 與正常組比較，模型組血清中的炎性因子TNF?α、IL?1β、IL?6 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，景虎通脈方各劑量組小鼠血清TNF?α、IL?1β、IL?6 水平均下降（P＜0.01），見表4。

圖2 Masson 染色在各組中的變化Fig.2 Changes of Masson staining in each group

表3 各組小鼠AS 斑塊內(nèi)膠原纖維表達（， n＝6）Tab.3 Expression of collagen fibers in AS plaques in mice of each group （， n＝6）

表3 各組小鼠AS 斑塊內(nèi)膠原纖維表達（， n＝6）Tab.3 Expression of collagen fibers in AS plaques in mice of each group （， n＝6）

注：與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 免疫組化檢測TLR4、Nur77 表達 正常組小鼠主動脈組織中未見斑塊，未見TLR4、Nur77 表達。與模型組比較，陽性對照組和景虎通脈方各劑量組小鼠主動脈組織TLR4 陽性面積減小 （P＜0.01）。與模型組比較，陽性對照組和景虎通脈方各劑量組小鼠主動脈組織Nur77 陽性面積增加（P＜0.05，P＜0.01），見圖3～4、表5。

表4 各組小鼠炎性因子水平（， n＝6）Tab.4 Levels of inflammatory factors in mice of each group （， n＝6）

表4 各組小鼠炎性因子水平（， n＝6）Tab.4 Levels of inflammatory factors in mice of each group （， n＝6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖3 TLR4 蛋白表達在各組中的變化（免疫組化）Fig.3 Changes of TLR4 protein expression in each group （immunohistochemical）

圖4 Nur77 蛋白表達在各組中的變化（免疫組化）Fig.4 Changes of Nur77 protein expression in each group （immunohistochemistry）

表5 各組小鼠AS 斑塊內(nèi)免疫組化陽性面積（， n＝6）Tab.5 Immunohistochemical positive area of AS plaques in mice of each group （， n＝6）

表5 各組小鼠AS 斑塊內(nèi)免疫組化陽性面積（， n＝6）Tab.5 Immunohistochemical positive area of AS plaques in mice of each group （， n＝6）

注：與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 Western blot 檢測TLR4、Nur77 表達 與正常組比較，模型組小鼠主動脈TLR4 蛋白表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組及景虎通脈方中、高劑量組小鼠主動脈TLR4 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），表明阿托伐他汀與景虎通脈方中、高劑量組均可抑制TLR4 的表達。與正常組比較，模型組小鼠主動脈Nur77 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組與景虎通脈方各劑量組小鼠主動脈Nur77 表達增加 （P＜0.01），表明阿托伐他汀與景虎通脈方各劑量組均可促進小鼠主動脈Nur77 蛋白表達（圖5、表6）。

注： A～F 分別為正常組、模型組、陽性對照組、景虎通脈方低劑量組、景虎通脈方中劑量、景虎通脈方高劑量組。

表6 各組小鼠主動脈Nur77 和TLR4 蛋白表達（， n＝6）Tab.6 Expression of aortic Nur77 and TLR4 proteins in mice of each group （， n＝6）

表6 各組小鼠主動脈Nur77 和TLR4 蛋白表達（， n＝6）Tab.6 Expression of aortic Nur77 and TLR4 proteins in mice of each group （， n＝6）

注：與正常組比較，** P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.7 小鼠動脈miRNA 差異基因的篩選及相關通路富集分析

3.7.1 RNA 的檢測與芯片雜交 樣品總RNA 經(jīng)定量并檢測其完整性，其中定量系統(tǒng)為NanoDrop ND?2000 （Thermo Scientific），檢測系統(tǒng)為Agilent Bioanalyzer 2100 （Agilent Technologies），質(zhì)檢合格后進行樣本的標記、芯片的雜交以及洗脫。其中標記物為Cyanine?3?CTP （Cy3）。標記好的RNA 經(jīng)過純化后和芯片雜交、洗脫，之后經(jīng)掃描得到原始圖像，其中掃描系統(tǒng)為Agilent Scanner G2505C （Agi?lent Technologies）。

3.7.2 數(shù)據(jù)分析 提取原始數(shù)據(jù)的軟件為Feature Extraction （Version10.7.1.1，Agilent Technologies），quantile 標準化和后續(xù)處理利用Genespring 軟件（Version13.1，Agilent Technologies），對標準化后的數(shù)據(jù)進行過濾，留下進行后續(xù)分析的樣本中至少有一組100%標記為D 探針。

3.7.3 差異miRNA 的篩選 差異miRNA 的篩選標準為倍數(shù)變化值（FC），其中選取的標準為FC≥2.0。選取C 組VSM 組差異的miRNA 集合，共198個，其中上調(diào)108 個，下調(diào)98 個，進行后續(xù)分析。

3.7.4 差異miRNA 的表達量變化 用“3.7.3” 項下差異miRNA 在陽性對照組、景虎通脈方低劑量組、景虎通脈方中劑量組、景虎通脈方高劑量組中的表達量來進行STEM 分析，篩選出變化趨勢P≤0.01 的miRNA 共49 個，以表達量繪制熱圖（圖6）。

圖6 差異miRNA 表達熱圖Fig.6 Heat map of differential miRNA expression

3.7.5 靶基因預測 利用Target Scan、PITA、microRNA org 3 個數(shù)據(jù)庫對差異miRNA 進行靶基因預測，取3 個數(shù)據(jù)庫預測到的靶基因交集，共1 277個，如圖7 所示，取共同基因進行通路富集分析（KEGG）。

3.7.6 KEGG 利用KEGG 分析來判定差異miRNA主要影響的生物學功能或通路，每個pathway 按照P值進行升序排列，富集越顯著（P值越?。?越靠前，結(jié)果如圖8 所示，選取P＜0.05 的前20 條通路進行下一步分析。結(jié)果顯示，景虎通脈方的作用于多條信號通路相關，關系最密切的是Axon guidance 通路，該通路可能與Nur77 及TLR4 存在相互調(diào)節(jié)作用，且在AS 中扮演重要角色［6?7］。其他也包括與AS相關的 Neurotrophin、PI3K／Akt 及 MAPK 通路等［8?9］。

圖7 靶基因預測Fig.7 Target genes prediction

4 討論

AS 的形成和發(fā)生與多種因素相關，其機制尚未完全闡釋，因此治療方面仍存在多種問題。中醫(yī)藥在AS 方面近些年取得一定進展，但機制研究不夠深入，加強相關的研究具有重要的實際意義［10?11］。

圖8 KEGG 通路富集分析Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis

中醫(yī)學認為，AS 的發(fā)病多與飲食失節(jié)、先天稟賦不足及年老體虛等因素有關。脾胃受損，肝腎虧虛，水谷精微失于健運，痰凝氣滯，血脈不利；痰瘀互結(jié)，日久生熱化毒，故“虛、痰、瘀、毒” 貫穿本病全過程，其病性屬本虛標實，本虛為脾氣不足、肝腎精虛，標實為痰濁、氣滯、瘀血、熱毒等。景虎通脈方為云南省榮譽名中醫(yī)、云南省心腦血管病專家趙淳教授的經(jīng)驗方。方中紅景天益氣活血，虎杖清熱解毒、活血祛濕，水蛭破血逐瘀（在此選用了水蛭素含有量最高、抗凝血活性最強的菲牛水蛭），茯苓健脾利濕化痰，隔山消補益肝腎、強健筋骨，全方可補氣益腎、活血通絡、化痰解毒，且虛、痰、瘀、毒同治，通補兼施。本方在治療AS 方面取得了較好的臨床效果［12］，但其具體機制尚待研究。為進一步深入評價景虎通脈方對AS 血管斑塊的作用，采用ApoE-／-小鼠，并用高脂飼料造模進行觀察。

AS 的發(fā)生常伴TC、TG、LDL?C 水平升高。其中，以LDL?C 升高為特征的血脂異常更是AS 形成的重要因素。經(jīng)景虎通脈方干預后，小鼠TC、TG、LDL?C 水平較模型組明顯降低。景虎通脈方能夠通過降低TC、TG、LDL?C 水平發(fā)揮抗AS 作用。通常認為HDL?C 對血管具有保護作用，但也有研究者提出在沒有心血管事件史的個體中，低濃度的HDL?C與未來發(fā)生心血管事件的風險成反比。但是，這種關系可能不適用于患有代謝異?；虮憩F(xiàn)為心血管疾病的患者［13］。本研究所采用的ApoE-／-小鼠本身存在脂質(zhì)代謝異常的情況，因此，HDL?C 水平升高與AS 發(fā)生的關系仍有待于進一步研究。

AS 斑塊的發(fā)展及其后期的脫落是引起心肌梗死、中風和外周血管疾病的危險因素。HE 和Masson 染色顯示模型組小鼠主動脈血管內(nèi)存在大量較不穩(wěn)定的斑塊［14］，而景虎通脈方各組小鼠則可見到明顯減少的血管斑塊面積以及主動脈斑塊中膠原表達的增加。因此，景虎通脈方可能通過減小斑塊面積、增加斑塊穩(wěn)定性來發(fā)揮治療AS 的作用。

炎癥反應的失調(diào)是AS 的特征之一，激活的T細胞或者其他免疫應答均會影響現(xiàn)有的斑塊，成為導致斑塊纖維帽破裂的重要因素之一，而炎癥與此密切相關。比如，IL?1β 過度活化會涉及多種炎性疾病的發(fā)病機制，包括類風濕性關節(jié)炎、I 型糖尿病和AS［15］，而降低IL?1β 可減少AS 患者復發(fā)性心血管事件發(fā)生率［16］。TNF?α 與IL?1β 可通過多種信號通路參與AS 的形成及破裂。IL?6 是前炎癥細胞因子，在炎癥反應早期發(fā)揮重要作用，它可促進單核細胞在血管內(nèi)皮下的聚集，并能促進體內(nèi)脂質(zhì)沉積從而有利于血管斑塊形成［17］。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清中TNF?α、IL?1β、IL?6 水平明顯升高。經(jīng)景虎通脈方干預后，血清TNF?α、IL?1β、IL?6 水平降低，提示景虎通脈方干預AS 斑塊形成的機制可能與抑制血清TNF?α、IL?1β、IL?6等炎性因子的水平相關。

大量研究顯示，TLR4 在AS 的炎癥病變中扮演重要角色，在AS 的各時期能分別檢測到其在多種細胞中表達［18］。TLR4 的表達促進了NF?κB p65 在體內(nèi)和體外的活化。抑制NF?κB 可減少炎癥因子TNF?α、IL?1β、IL?6 的表達，降低TC 和LDL?C 水平［19?20］。AS 形成與TLR4 激活關系密切。因此，抑制TLR4 通路過度激活具有潛在的治療意義，而Nur77 對TLR4 的負向調(diào)控研究不斷受到重視。

Nur77 是AS 的早期反應基因，是炎癥反應上游調(diào)節(jié)的關鍵［21］，與AS 形成過程中的關鍵細胞如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞等密切相關。Nur77基因的缺陷可激活TLR4 通路并刺激巨噬細胞分泌促炎因子，從而加重炎癥反應。同時，Nur77 可調(diào)控NF?κB 信號傳導影響炎癥反應。Nur77 降低，TLR4 和TNF?α 表達增加，促使巨噬細胞向促炎性表型方向極化，并且這與增強NF?κB 活性相關。上調(diào)ApoE-／-小鼠Nur77 表達可減少高脂飲食所致AS斑塊，并可減少脂質(zhì)沉積、泡沫細胞形成和多種炎性因子的生成，同時，也能對抗單核細胞內(nèi)皮細胞之間的黏附反應［22?23］。故調(diào)節(jié)Nur77 的表達可能成為體內(nèi)抑制過度炎癥反應的潛在治療靶點。前期研究顯示，景虎通脈方可通過調(diào)節(jié)頸動脈粥樣硬化兔中TLR4、NF?κB、MCP?1 mRNA 的表達發(fā)揮作用［3］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，景虎通脈方含藥血清可抑制泡沫細胞的炎癥反應，該作用可能與抑制泡沫細胞的清道夫受體CD36 和CD204 的表達相關［24］，而清道夫受體在動脈粥樣硬化的病變中與TLR4 密切相關［25］。本研究免疫組化和Western blot 結(jié)果均顯示，模型小鼠中TLR4 表達增高，經(jīng)景虎通脈方干預后其表達可降低。同時，模型小鼠中Nur77 蛋白表達降低，而景虎通脈方干預后其表達可增高。這些結(jié)果提示，景虎通脈方可能通過提高Nur77 蛋白表達、降低TLR4 表達，減少炎癥因子TNF?α、IL?1β、IL?6 的分泌，從而減少模型小鼠中血管斑塊的形成。

為了進一步深入研究景虎通脈方的作用機制，運用miRNA 基因芯片進行了分析。結(jié)果顯示，有多條信號通路與其作用機制相關，值得注意的是軸突導向（Axon guidance） 通路中的差異基因變化最顯著。Axon guidance 是1993 年左右被兩個課題組先后發(fā)現(xiàn)并報道，在神經(jīng)的發(fā)育及病理變化中扮演重要角色，后來發(fā)現(xiàn)其家族蛋白與多種免疫調(diào)節(jié)相關。最新的報道顯示，它與AS 病變中扮演重要角色的多種細胞密切相關［26］，而且Axon guidance 家族蛋白與Nur77 可能存在相互調(diào)控關系［6］。進一步的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，景虎通脈方的作用可能與TLR4相關且在AS 扮演重要角色的Neurotrophin、PI3K／Akt 及MAPK 等通路存在較高相關性［27］。這些結(jié)果提示，景虎通脈方可能有多種作用機制，如該方可能通過調(diào)節(jié)血脂，減少炎性因子分泌，調(diào)控Nur77表達，降低TLR4 表達，起到保護血管，穩(wěn)定AS 斑塊的目的；該方也可能通過調(diào)節(jié)與Nur77 相關的Axon guidance 蛋白家族的基因變化從而干預動脈粥樣硬化的炎癥反應。這些可能的作用機制，如該方是如何調(diào)控Nur77、Axon guidance 蛋白家族以及TLR4 通路發(fā)揮抗AS 作用，以及具體哪些miRNA 或蛋白發(fā)生明顯變化等均有待進一步深入研究。