茯苓配方顆粒、豬苓配方顆粒標準湯劑的質(zhì)量評價

劉 潔 徐云輝 張倩倩 朱敏航 華茉莉 周 靖*

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院， 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室， 上海201203；2.復旦大學藥學院， 上海201203）

茯苓、豬苓均是臨床應用歷史悠久的常用中藥，前者為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，性平，味甘、淡，具有利水滲濕、健脾寧心之功效［1］，中醫(yī)有“十藥九茯苓”之說［2］；后者為多孔菌科真菌豬苓Polyporus um?bellatus（Pers.） Fr.的干燥菌核，性平，味甘、淡，具有利水滲濕之功效［1］?！侗静菥V目》 明確記載：“豬苓與茯苓同功，但入補藥不如茯苓也”。

在2015 年版《中國藥典》 中，茯苓藥材項下仍無明確含有量測定項，而豬苓藥材項下規(guī)定麥角甾醇含有量不得低于0.07%。目前，一般認為茯苓活性成分為三萜和多糖［3］，而豬苓為甾體和多糖［4］。對于茯苓中三萜和豬苓中甾體類，國內(nèi)已開展諸多研究［5?8］，發(fā)現(xiàn)前者含有量極低，單一成分大多不足萬分之一［5］，可能是《中國藥典》 未將其列為茯苓藥材及飲片含有量測定項的主要原因；后者含有量稍高，但麥角甾醇也不足千分之一［6］。對于茯苓、豬苓中多糖含有量的測定，大多通過苯酚?硫酸法水解顯色，以葡萄糖（單糖）為對照，再采用紫外分光光度法計算［9］，但該方法誤差大，缺少專屬性，無法有效表征2 種藥材中多糖類成分的組成差異。

中藥配方顆粒是單味中藥飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒而成，中醫(yī)臨床配方后供患者沖服使用，也稱為免煎中藥飲片，是對傳統(tǒng)中藥飲片的一種改進。由于配方顆粒已失去中藥飲片的外在形態(tài)特征，因此對其質(zhì)量控制標準的制定顯得尤為重要，可有效客觀地反映不同藥材的內(nèi)在質(zhì)量與特征，以保證臨床用藥的可靠性和量效化［10］。

本實驗參考2016 年8 月國家藥典委員會發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術要求》（征求意見稿） 相應要求，前期制備多批次茯苓、豬苓標準湯劑。經(jīng)反復研究發(fā)現(xiàn)，標準湯劑中茯苓所含三萜和豬苓所含甾體類成分的提取轉(zhuǎn)移率極低，即使配制每1 mL 含10 g 藥材的供試品溶液，HPLC 法分析時仍低于檢測限，無法將其作為有效的含有量測定指標［11?12］。核苷類成分也是真菌類中藥特有的活性物質(zhì)［13］，而且在水煎液中能達到較好轉(zhuǎn)移，雖然其含有量偏低，但基本可實現(xiàn)檢測，同時采用內(nèi)標法以減小誤差。

本實驗首先以茯苓、豬苓中的水溶性多糖為研究對象，結(jié)合多糖水解后單糖的衍生化處理［14］，通過HPLC 指紋圖譜展示多糖組成，可較好地實現(xiàn)兩者有效區(qū)分。同時，以2 種藥材中共有的微量核苷為研究對象，選擇梔子苷作為內(nèi)標，再通過HPLC 法同時測定尿苷、鳥苷、腺苷含有量，計算相應轉(zhuǎn)移率，可有效控制茯苓配方顆粒、豬苓配方顆粒質(zhì)量，以期為相關標準的制定提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 U3000 型高效液相色譜儀 （美國Dionex 公司）；變色龍工作站（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Extend C18、Zorbax SB?Aq 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Agilent 公司）；AL204 型電子天平 （瑞士Mettler?Toledo 公司）；FD?1A?50 型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；Millipore 超純水儀（德國Merck 公司）。

1.2 試劑與藥物 茯苓藥材飲片22 批 （批號FL?001～FL?022）、豬苓藥材飲片20 批 （批號ZL?001～ZL?020），產(chǎn)自安徽、云南、陜西等省，經(jīng)上海醫(yī)藥工業(yè)研究院華茉莉研究員鑒定為正品，按2015 年版《中國藥典》 方法檢測均合格。D?半乳糖（批號840215）、L?鼠李糖（批號839801）、D?木糖（批號820115） （上海試劑二廠）；D?甘露糖（批號 F20120107）、無水葡萄糖 （批號20070115） （國藥集團化學試劑有限公司）；D?核糖（批號1451793）、D?巖藻糖（批號050M1909）（美國Sigma 公司）；梔子苷（純度97.6%，批號110749?201718）、鳥苷（純度93.6%，批號111977?201501）、尿苷 （純度 99.5%，批號 110887?201803）、腺苷 （純度 99.7%，批號 110879?201703） 對照品（中國食品藥品檢定研究院）。1?苯基?3?甲基?5?吡唑啉酮［PMP，批號H1718064，阿拉丁試劑（上海） 有限公司］。乙腈為色譜純（阿達瑪斯試劑有限公司）；其他試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水（Milli?Q 超純水儀制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準湯劑制備 參考2016 年8 月國家藥典委員會發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術要求》 （征求意見稿） 相應要求制備。稱取茯苓、豬苓飲片各約100 g，加9 倍量水浸泡一定時間，煮沸后再煎煮30 min，趁熱過濾，濾渣加7 倍量水，煮沸后再煎煮30 min，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至一定體積后冷凍干燥，即得。

2.2 多糖水解后單糖組成HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 Agilent Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?50 mmol／L 磷酸鹽緩沖液（pH ＝6.80） （17.5 ∶82.5）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長250 nm；進樣量10 μL。

2.2.2 多糖提取 精密稱取“2.1” 項下標準湯劑適量，加水至完全溶解，配制成每1 mL 相當于含1 g 茯苓或豬苓飲片的溶液，緩慢滴加無水乙醇至含醇量約80%，混勻，4 ℃冰箱中靜置過夜，離心，沉淀，冷凍干燥，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取“2.2.2” 項下多糖20 mg，加入5.00 mL 4 mol／L 鹽酸，90 ℃水浴加熱6 h，取出，加入適量甲醇進行減壓濃縮，重復操作數(shù)次以除去鹽酸，殘渣加水定容至1 mL，得水解液。再進行衍生化，吸取100 μL 水解液，加入0.3 mol／L NaOH 溶液50 μL、0.5 mol／L 1?苯基?3?甲基?5?吡唑啉酮（PMP） 甲醇溶液60 μL，70 ℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，加入50 μL 0.3 mol／L 鹽酸中和，加入適量氯仿萃取數(shù)次，水層定容至1 mL，即得。

2.2.4 對照品溶液制備 精密稱取甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖對照品適量，加水制成每1 mL 含上述單糖各1 mg 的貯備液，各精密移取100 μL，按 “2.2.3” 項下方法衍生化，即得。

2.2.5 精密度試驗 取同一供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，選擇半乳糖作為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD均小于3%，相對峰面積RSD 也均小于3%，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于1、2、4、6、12、24 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于3%，相對峰面積RSD 也均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批標準湯劑，按“2.2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得共有峰相對保留時間RSD 均小于3%，各共有峰相對峰面積RSD 均小于8.73%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 指紋圖譜生成及相似度分析 在“2.2.1”項色譜條件下檢測22 批茯苓供試品溶液、20 批豬苓供試品溶液，所得HPLC 指紋圖譜導入中藥指紋圖譜相似度分析軟件（2004A 版），見圖1～2，相似度見表1。

表1 各樣品相似度測定結(jié)果Tab.1 Results of similarity determination of various samples

由此可知，同一品種水溶性多糖的單糖組成相似度較高，但不同品種其共有色譜峰存在明顯差異；不同批次茯苓飲片指紋圖譜中有5 個共有峰，通過與對照品比對確認為甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖；不同批豬苓飲片指紋圖譜中有8個共有峰，通過與對照品比對確定其中7 個為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖，表明可在一定程度上表征和區(qū)分2 種飲片。

2.3 核苷含有量測定

2.3.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB?Aq 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?水，梯度洗脫，程序見表2；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖3。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

圖2 豬苓單糖組成的指紋圖譜Fig.2 Fingerprints for monosaccharide composition of P.umbellatus

圖3 各核苷HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various nucleosides

2.3.2 內(nèi)標溶液制備 精密稱取適量梔子苷對照品，甲醇溶解定容，制成每1 mL 含0.6 mg 該成分的溶液，即得。

2.3.3 對照品溶液制備 精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷對照品，加水制成每1 mL 分別含三者0.2、0.1、0.2 mg 的貯備液，各精密移取1 mL，置于10 mL量瓶中，精密加入1.00 mL 內(nèi)標溶液，加水至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 供試品溶液制備 精密稱取標準湯劑冷凍干燥粉末200 mg，置于10 mL 量瓶中，加8 mL 水超聲處理30 min，精密加入1.00 mL 內(nèi)標溶液，加水至刻度，濾過，即得。

2.3.5 線性關系考察 精密移取0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL “2.3.3” 項下貯備液，精密加入1.00 mL 內(nèi)標溶液，加水至刻度，搖勻，濾過，得不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，各精密吸取10 μL，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程分別為尿苷Y＝87.986X＋0.031 1 （r＝0.999 9）、鳥苷Y＝97.446X＋0.015 1（r＝1.000 0）、腺苷Y＝120.26X＋0.050 2 （r＝0.999 9），分別在1～100、0.5～5、1～100 μg／mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.6 精密度試驗 取同一份供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得茯苓飲片中尿苷、鳥苷、腺苷峰面積RSD 分別為0.87%、0.43%、0.49%，豬苓飲片中分別為0.38%、1.20%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復性試驗 取同一批樣品，按“2.3.4”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得茯苓飲片中尿苷、鳥苷、腺苷含有量RSD 分別為2.65%、1.32%、0.78%，豬苓茯苓飲片中分別為1.39%、0.60%、1.92%，表明該方法重復性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得茯苓飲片中尿苷、鳥苷、腺苷峰面積RSD 分別為0.52%、0.42%、0.46%，豬苓飲片中分別為0.58%、0.55%、0.69%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的同一批樣品9 份，每份0.1 g，精密加入高、中、低質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“2.3.4” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，茯苓飲片中尿苷、鳥苷、腺苷平均加樣回收率分別為96.66% （RSD ＝1.32%）、99.76%（RSD ＝1.56%）、100.15%（RSD ＝1.30%），豬苓飲片中分別為101.54% （RSD ＝1.85%）、98.13% （RSD ＝ 1.79%）、101.01%（RSD＝1.66%）。

2.4 樣品含有量測定 取不同批次樣品，按“2.3.4” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表3。

表3 各核苷含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.3 Results of content determination of various nucleosides （mg／g）

3 討論與結(jié)論

本實驗在制備茯苓配方顆粒、豬苓配方顆粒標準湯劑的過程中，對影響出膏率的工藝參數(shù)（浸泡時間、加水量、煎煮時間） 進行了比較。最終確定，兩者出膏率分別為1.13%～5.88%、1.15%～3.60%。

多糖是茯苓、豬苓重要的活性物質(zhì)［15］，由于中藥配方顆粒終產(chǎn)品大多會添加淀粉或糊精類輔料，故采用分光光度法測定其含有量，但并無實際質(zhì)量控制意義。因此，本實驗建立其單糖組成的HPLC 指紋圖譜，以共有峰特征來區(qū)分茯苓、豬苓差異，并將其作為標準湯劑的質(zhì)量檢查項，對相關配方顆粒的質(zhì)量控制是非常必要的。

核苷作為真菌類藥材中公認的活性成分［16?17］，對其含有量進行測定是茯苓標準湯劑、豬苓標準湯劑有效的質(zhì)量控制方法，由于該成分含有量偏低，故采用內(nèi)標法以減小誤差。本實驗考察了不同內(nèi)標（如肌苷、紅景天苷等） 的效果，最終選擇不干擾目標成分分析、分離度好、響應值高的梔子苷，可用于測定標準湯劑中尿苷、尿苷、腺苷含有量，而且該方法穩(wěn)定可靠。

綜上所述，本實驗制備的各批次茯苓配方顆粒、豬苓配方顆粒標準湯劑均一性較高，質(zhì)量相對穩(wěn)定。將多糖水解后單糖組成的HPLC 指紋圖譜與核苷的含有量測定相結(jié)合時，可有效控制上述2 種標準湯劑的質(zhì)量，并為其標準制定提供參考依據(jù)。