通絡止痛膠囊中4 種成分測定及HPLC 指紋圖譜建立

周 和 譚翔勻 馮 華 王 奧

（遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院， 貴州遵義563002）

通絡止痛膠囊由虎杖、當歸、獨活、威靈仙、全蝎、蘄蛇、杜仲等16 味藥材組成，方中虎杖利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛；當歸補血活血、調(diào)經(jīng)止痛；獨活祛風除濕、通痹止痛，配合其他藥材可充分發(fā)揮該制劑搜風通絡、活血止痛、祛風除濕的功效，主要用于骨痹、風濕痹血瘀阻絡癥所致肌肉麻木及關節(jié)、腰頸疼痛等癥［1］。但該制劑藥味多，成分復雜，傳統(tǒng)的單一成分測定難以全面控制其質(zhì)量，而且存在費時費力、成本高昂的缺點，以及對照品質(zhì)量不穩(wěn)定、供應不充足等因素的制約。

近年來，一測多評法越來越受到重視，在2015 年版《中國藥典》 編制大綱一部綱要中，國家藥典委員會也重點提出要引入該方法［2］，它在僅使用1 種對照品的情況下，利用相對校正因子來同時測定其他成分的含有量，具有經(jīng)濟、高效、制約因素少的優(yōu)勢，已成功應用于清熱止咳顆粒、細辛、新疆軟紫草、羅布麻葉等多種中藥材及其復方制劑的質(zhì)量控制［3?10］。另外，指紋圖譜可反映整體化學成分信息，而一測多評法可用于定量，兩者聯(lián)合應用能更科學地評價中藥及其復方制劑的整體質(zhì)量［11?17］。因此，本實驗建立一測多評法［18］同時測定通絡止痛膠囊中虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯的含有量，并結合HPLC 指紋圖譜來反映該制劑整體化學成分信息，可為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC?1260 型高效液相色譜儀（美國Ag?ilent 公司）；AB204?S 型電子天平（北京中恒日鑫科技有限公司）；KQ?500DV 型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為11575?200502、111773?201614、110822?201710、111583?201605）。通絡止痛膠囊（批號161201、161202、161203 購于遵義市中醫(yī)院，批號19091601、19091602、19091603、19092301、19092302、19092303、19092304，自制）。甲醇、磷酸為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters XSelect C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A） ?0.5% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，80%～60% B；15～25 min，60%～50% B；25～35 min，50% B；35～45 min，50%～30%B；45～60 min，30%B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長330 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成分別含虎杖苷0.830 4 mg／mL、阿魏酸0.053 6 mg／mL、蛇床子素0.782 9 mg／mL、二氫歐山芹醇當歸酸酯1.245 5 mg／mL 的貯備液，精密吸取0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，置于5 個10 mL 量瓶中，甲醇稀釋，即得。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊內(nèi)容物適量，研細，取約3.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入30 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，靜置至室溫，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例制備缺獨活（含蛇床子素、二氫歐山芹醇）、缺虎杖（含虎杖苷）、缺當歸 （含阿魏酸） 的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適應性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分色譜峰達到基線分離，理論塔板數(shù)均大于5 000，與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，陰性無干擾。

2.3.2 線性關系考察 取“2.2.1” 項下對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣10 μL 測定，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，分別以信噪比（S／N） 3、10 計算檢測限、定量限，結果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 取同一供試品溶液（批號161201），在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 分別為0.39%、1.04%、0.30%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取膠囊（批號161201） 內(nèi)容物適量，按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 分別為0.45%、1.70%、0.57%、0.94%，表明該方法重復性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號161201），于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 分別為0.93%、1.86%、1.35%、1.62%，表明供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含有量已知的膠囊9 份，每份1.50 g，每3 份1 組，精密加入80%、100%、120% 水平對照品溶液，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

2.3.7 相對校正因子計算 取“2.2.1” 項下對照品溶液，在 “2.1” 項色譜條件下進樣2、5、10、12、15、20 μL 測定，以虎杖苷為內(nèi)標，計算其他3 種成分的相對校正因子，結果見表3。

2.4 耐用性考察

2.4.1 儀器、色譜柱 本實驗考察了Agilent 1260、Waters 2695 色譜儀，以及XSelect C18、Eclipse C18、Diamonsil C18色譜柱對相對校正因子的影響，結果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜2.50%）。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.2 檢測波長 本實驗考察了檢測波長332、330、328 nm 對相對校正因子的影響。結果，阿魏酸相對校正因子分別為0.552、0.553、0.556，RSD 為0.38%；蛇床子素相對校正因子分別為0.835、0.832、0.835，RSD 為0.21%；二氫歐山芹醇當歸酸酯相對校正因子分別為1.153、1.146、1.151，RSD 為0.31%，可知均無明顯影響。

2.4.3 體積流量 本實驗考察了體積流量0.8、1.0、1.2 mL／min 對相對校正因子的影響。結果，阿魏酸相對校正因子分別為 0.558、0.553、0.568，RSD 為1.36%；蛇床子素相對校正因子分別為0.837、0.832、0.825，RSD 為0.73%；二氫歐山芹醇當歸酸酯相對校正因子分別為1.159、1.146、1.165，RSD 為0.84%，可知均無明顯影響。

2.4.4 柱溫 本實驗考察了柱溫20、25、30 ℃對相對校正因子的影響。結果，阿魏酸相對校正因子分別為0.547、0.553、0.560，RSD 為1.18%；蛇床子素相對校正因子分別為 0.821、0.832、0.835，RSD 為0.89%；二氫歐山芹醇當歸酸酯相對校正因子分別為1.158、1.146、1.132，RSD 為1.14%，可知均無明顯影響。

2.4.5 磷酸體積分數(shù) 本實驗考察了磷酸體積分數(shù)0.4%、0.5%、0.6% 對相對校正因子的影響。結果，阿魏酸相對校正因子分別為0.537、0.553、0.562，RSD 為2.30%；蛇床子素相對校正因子分別為0.861、0.832、0.839，RSD 為1.79%；二氫歐山芹醇當歸酸酯相對校正因子分別為1.105、1.146、1.143，RSD 為2.02%，可知均無明顯影響。

2.5 色譜峰定位 精密吸取對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見表5。由此可知，不同儀器、色譜柱對相對保留時間的影響較小，RSD 均小于5%，表明相對保留時間法可用于定位色譜峰。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝9）

表3 各成分相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

表4 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6 樣品含有量測定 取10 批膠囊，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表6，可知2 種方法所得結果接近，差異百分比 （PD） 均小于2%。

表5 各成分相對保留時間Tab.5 Relative retention time of various constituents

2.7 HPLC 指紋圖譜建立

2.7.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（S1，批號161201），在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6次，以虎杖苷為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD 為0.15%～0.46%，相對峰面積RSD 為0.12%～0.97%，所采集指紋圖譜的相似度均大于0.97，表明儀器精密度良好。

表6 各成分含有量測定結果（mg／g）Tab.6 Results of content determination of various constituents （mg／g）

2.7.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（S1），于0、2、4、8、12、16、24 h 在“2.1” 項下色譜條件進樣測定，以虎杖苷為參照峰，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于1.72%，指紋圖譜相似度均大于0.96，表明溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.3 重復性試驗 取樣品（S1），平行制備6份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以虎杖苷為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.59%，相對峰面積RSD 均小于1.43%，指紋圖譜相似度均大于0.96，表明該方法重復性良好。

2.7.4 指紋圖譜生成及相似度評價 取10 批膠囊內(nèi)容物適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版），選擇樣品S1 圖譜作為對照指紋圖譜，通過多點校正全譜匹配后確定21 個共有峰，生成指紋圖譜共有模式，見圖2。另外，10 批樣品相似度分別為0.984、0.996、0.973、0.980、0.982、0.962、0.971、0.978、0.985、0.987，均大于0.95，表明不同批次樣品之間的差異較小，穩(wěn)定性良好。

圖2 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints for ten batches of samples

2.7.5 共有峰 21 個共有峰的峰面積總和占色譜峰總面積的93.51%，表明它代表性較好，然后在供試品溶液中加入對照品溶液以考察相應共有峰是否增高，同時與對照品溶液圖譜進行比較（圖1），確定6 號峰為虎杖苷，7 號峰為阿魏酸，20 號峰為蛇床子素，21 號峰為二氫歐山芹醇當歸酸酯，并選擇峰形好、位置適中、前后無色譜峰干擾的虎杖苷作為參照峰（S 峰）。再計算各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD，結果見表7～8，可知它們均小于2.0%，表明指紋圖譜穩(wěn)定性良好。

表7 共有峰相對保留時間Tab.7 Relative retention time of common peaks

表8 共有峰相對峰面積Tab.8 Relative peak areas of common peaks

3 討論

3.1 指標成分、內(nèi)標選擇 根據(jù)通絡止痛膠囊中16 味藥材的主要成分及其藥理作用，本實驗考察了虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、毛蕊花糖苷、蒿本內(nèi)酯、松脂醇二葡萄糖苷。其中，毛蕊花糖苷、蒿本內(nèi)酯含有量太低，松脂醇二葡萄糖苷不易提取分離，故選擇虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯作為指標成分。另外，虎杖苷在供試品溶液中含有量高，位置適中，峰形好，分離度大，故選擇其作為內(nèi)標。

3.2 前處理方法選擇 本實驗比較了乙醇、甲醇，發(fā)現(xiàn)后者提取率高，基線平穩(wěn)，圖譜指紋性強，故選擇甲醇作為提取溶劑；比較了超聲提取、回流提取、索氏提取，發(fā)現(xiàn)三者無明顯差異，但超聲提取操作方便快捷，易于制備供試品溶液，故選擇其作為提取方法；比較了提取時間50、60、70 min，發(fā)現(xiàn)提取60 min 后各成分提取率基本一致，故選擇60 min 作為提取時間。

3.3 色譜條件選擇 本實驗所測成分的極性相差較大，故采用梯度洗脫模式以實現(xiàn)快速分離?？疾炝思状?水、甲醇?磷酸、甲醇?醋酸、乙腈?水、乙腈?磷酸、乙腈?醋酸，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.5%磷酸洗脫效果最好，故以其為流動相。各成分紫外吸收波長分別為虎杖苷306 nm、阿魏酸316 nm、蛇床子素330 nm、二氫歐山芹醇當歸酸酯330 nm，四者比較接近，采用DAD 檢測器進行190～400 nm 全波長掃描，通過分析三維圖譜，兼顧信號強度和檢測靈敏度，發(fā)現(xiàn)在330 nm 波長附近各成分色譜圖的基線噪音較低，均有較高的響應，有利于含有量測定，故選擇其作為檢測波長。

4 結論

指紋圖譜具有整體性、相似性的特點，可快速判斷藥味是否缺少，但不能準確反映化學成分信息；一測多評法定量準確，但受制于中藥的復雜性，也并非所有活性成分均能如此測定。本實驗首次建立通絡止痛膠囊HPLC 指紋圖譜，并通過一測多評法同時測定虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯的含有量，發(fā)現(xiàn)所得結果與外標法接近，而且該方法簡便高效，重復性好，可為該制劑整體質(zhì)量控制提供參考。